إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي

الهدف العام من هذا المقال هو تقديم طرق تحضير وتوصيف جسيمات نانوية تحاكي البروتينات الدهنية عالية الكثافة والمحملة بعامل نمو الأعصاب. تم استخدام التجانس البسيط لتحضير جسيمات نانوية تحاكي البروتينات الدهنية عالية الكثافة الطبيعية. وتتميز هذه الإجراءات بالبساطة والقابلية للتوسع.

علاوة على ذلك، حسنت الجسيمات النانوية بشكل كبير من كفاءة الحبس، وكذلك NGF و APOA1 في الجسيمات النانوية. وقد تم التغلب على تحديات مختلفة لتوصيف الجسيمات النانوية، بما في ذلك فصل NGF غير المحمل عن جسيمات NGF النانوية، وإجراء دراسات نصف قطرية موثوقة في المختبر، والتوافر الحيوي لجسيمات NGF النانوية. للبدء، اخلط 10 µL من NGF مع 10 µL من protamine USP في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL واتركه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوين المعقد.

بعد ذلك، أضف 59 µL من الفوسفاتيديل كولين و 11 µL من السفينغوميالين إلى قارورة زجاجية. أضف أيضاً 4 µL من الفوسفاتيديل سيرين، و 15 µL من أوليات الكوليستريل، و 45 µL من توكوفيريل بولي إيثيلين جليكول سكسينات. اخلط المكونات وبخّر الإيثانول تحت تيار خفيف من النيتروجين لمدة خمس دقائق تقريبًا.

يجب أن تشكل جميع المسوغات غشاءً زيتياً رقيقاً في قاع القارورة الزجاجية. أضف 1 mL من الماء فائق النقاء إلى القارورة وقم بعملية التجانس بسرعة 9,500 rpm لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوين الجسيمات النانوية النموذجية، أو NPs. بعد ذلك، أضف المعقد المُحضّر إلى الجسيمات النانوية النموذجية NPs.

يتم تحضين المعلق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التقليب، باستخدام قضيب تقليب صغير في القارورة الزجاجية. تُبرد الجسيمات النانوية (NPs) عن طريق التقليب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد التبريد، يُضاف 106 µL من apolipoprotein A-1 ويُقلب في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لتكوين الجسيمات النانوية النهائية المحاكية لـ NGF HDL.

قم بقياس حجم الجسيمات وجهد زيتا باستخدام محلل الجسيمات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يُستخدم عمود كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي المترابط لفصل NGF غير المحمل عن الجسيمات النانوية الشبيهة بـ NGF HDL، وتحديد كفاءة احتجاز NGF. ولتحضير العمود، انقل 15 ملليلتر من معلق sepharose 4B CL إلى دورق سعة 50 ملليلتر.

قم بتقليب معلق الخرز واسكب جزءاً منه في عمود. انقر على العمود برفق للتخلص من الفقاعات. اترك المذيب يتصفى والخرز يترسب لبضع دقائق.

استمر في إضافة ما تبقى من المعلق. اشطف الجدار الداخلي للعمود لتنظيف الحبيبات. قم بتصريف المذيب حتى يصبح مستوى المذيب أعلى قليلاً من الجزء العلوي للطور الساكن.

بعد ذلك، اغسل وعادل العمود باستخدام 20 milliliters من محلول phosphate-buffered saline بتركيز 1X. ولقياس كفاءة احتجاز NGF، قم بتحميل 200 microliters من NGF HDL-mimicking NPs على العمود واستخلصها باستخدام 1X PBS. وكما في السابق، اجمع ما مجموعه 12 جزءاً بحجم one-milliliter لكل منها.

قم بمعالجة مسبقة لثمانية أنابيب دياليز باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أضف 30 milliliters من وسط التحرير إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، قم بتسخينه حتى 37 degrees Celsius في هزاز بسرعة هز تبلغ 135 rpm.

أغلق أنبوب الديلزة وضعه في وسط التحرير. اسحب بسرعة 100 µL من وسط التحرير من خارج أنبوب الديلزة لتكون عينة الزمن صفر. ضع العينة فوراً في درجة حرارة -20 °C لتحليلها لاحقاً.

أضف 100 µL من وسط التحرير الطازج إلى أنبوب الطرد المركزي لاستبدال العينة المسحوبة. ثم ابدأ المؤقت. وعند الساعات 1، و2، و4، و6، و8، و24، و48، و72، اسحب 100 µL من وسط التحرير واستبدلها بـ 100 µL من الوسط الطازج.

ضع العينات المسحوبة فوراً في درجة حرارة -20 °C للتحليل اللاحق. وبعد عملية تجانس لمدة ثلاث دقائق، تم الحصول على أحجام جسيمات متسقة للجسيمات النانوية الأولية. وبلغ حجم جسيمات NGF النانوية النهائية 170 nm مع توزيع حجمي ضيق وأحادي التشتت.

تم فصل NGF غير المحمل والجسيمات النانوية تماماً باستخدام عمود الترشيح الهلامي. وقد خرجت الجسيمات النانوية في الكسور من الثاني إلى الرابع. وأشار قياس ELISA إلى أن NGF الحر قد خرج في الكسور من السابع إلى العاشر.

بلغت كفاءة الحجز المحسوبة لـ NGF حوالي 66%. ويظهر هنا التحرر في المختبر لجسيمات NGF النانوية. فمن خلال إضافة PBS و BSA إلى وسط التحرر، مرّ NGF الحر عبر غشاء الديلزة بنسبة استعادة تجاوزت 85%. وعلى العكس من ذلك، أظهرت جسيمات NGF النانوية ملف تحرر بطيئاً، حيث تم تحرر حوالي 10% من NGF من الجسيمات النانوية على مدار 72 ساعة. وقد حفزت جسيمات NGF النانوية نمو الاستطالات العصبية في خلايا PC12 بدرجة مماثلة لـ NGF الحر.

لوحظ نمو الزوائد العصبية بوضوح تحت المجهر لكلتا المجموعتين عند استخدام جرعة 50 nanograms per milliliter. وأدت جسيمات NGF النانوية إلى زيادة تركيز البلازما بشكل كبير وتقليل امتصاص NGF في كبد وفل كلية وطحال الفئران. كما ساعدت الجسيمات النانوية المحاكية لـ HDL بروتين NGF، مما أتاح فترة عمر نصف طويلة في الاستقرار داخل الجسم الحي.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن تحضير جسيمات نانوية أحادية التشتت في غضون ثلاث دقائق باستخدام طريقة التجانس إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام تدفق لطيف من النيتروجين لتبخير المذيب والتأكد من عدم وجود بقايا دهنية ملتصقة بجدار الحاوية بعد عملية التجانس. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع جسيمات نانوية تحاكي HDL باستخدام طريقة التجانس وكيفية توصيف الجسيمات النانوية المحملة بـ NGF.