الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

الهدف العام من عزل قطرات الدهون لقياس الطيف الكتلي الكمي هو فهم وظيفة هذه العضيات ، على سبيل المثال ، في تكاثر مسببات الأمراض مثل فيروس التهاب الكبد C. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض المعدية مثل سبب ارتباط مسببات الأمراض بالقطرات للتكاثر. يمكن عزل قطرات الدهون في غضون ست إلى سبع ساعات.

وخلال هذا الإجراء ، من المهم تجنب تلوث الكيراتين. للبدء ، قم بإزالة 50 مل من كل زجاجة من وسط DMEM وأضف 50 مل من مصل ربلة الساق الجنينية المخلل في الكلى. بعد ذلك ، قم بإذابة 50 ملليغرام من الكربون 13 المسمى ليسين و 50 ملليغرام من الكربون 13 المسمى الأرجينين في ملليلتر واحد من المتوسط.

تخلط جيدا وتضاف الأحماض الأمينية إلى DMEM بالإضافة إلى وسيط FCS. ثم أضف PenStrep وبديل الجلوتامين. قم بتصفية الوسط المعقم باستخدام مرشح 0.45 ميكرون ، وقم بتسمية الزجاجة على أنها وسيط سيليك ثقيل.

لتحضير الوسط الخفيف ، كرر هذه الخطوات باستخدام 50 ملليغرام من الأرجينين و 50 ملليغرام من اللايسين. قم بتسمية الزجاجة بأنها وسيطة SILAC خفيفة. قم بتربسين الخلايا ، وقم بتقسيمها إلى بئرين من صفيحة ثقافة من ستة آبار.

يجب أن يحتوي أحد البئر على ملليلترين من وسط SILAC الثقيل ، والآخر ، ملليلترين من وسط SILAC الخفيف. استزراع الخلايا لستة مقاطع على الأقل. بعد ستة مقاطع ، يجب أن يكون دمج الأحماض الأمينية الثقيلة أكثر من 95٪ حصاد مليون خلية من مجموعات الخلايا الثقيلة والخفيفة لتحليل فعالية الاندماج.

بعد غسل الخلايا في 1X PBS ، قم بتكبيلها عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 160 مرة جم وأربع درجات مئوية. أعد تعليق كريات الخلية في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت MS. بعد ذلك ، احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة.

ثم ، تحلل الخلايا عن طريق الصوتنة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة بقايا الخلية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 11،000 مرة جم وأربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وحدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة بروتين متوافقة مع المنظفات.

ثم امزج 75 ميكروغراما من البروتين مع ستة عينات عازلة. بعد الغليان عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، افصل البروتينات عن طريق SDS-PAGE في SDS الذي يعمل بمخزن مؤقت عند 180 مسمارا لمدة ساعة واحدة تقريبا. بعد تلطيخ Coomassie ، قم باستئصال نفس شريط البروتين وتحليل فعالية الدمج عن طريق تحليل MS.

إصابة السكان الخفيفين من الخلايا بفيروس التهاب الكبد الوبائي سي عن طريق احتضانها بمخزونات ليفية لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. توسيع الخلايا الخفيفة المصابة بفيروس التهاب الكبد C والخلايا الثقيلة غير المصابة كما هو موضح في بروتوكول النص. إذا كنت تستخدم سلالة HCV تحمل جين مقاومة بلاستيسيدين ، أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من بلاستيسيدين S إلى الوسط الخفيف لاختيار الخلايا الإيجابية لفيروس التهاب الكبد C.

قبل يوم واحد من عزل قطرات الدهون ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وجرب ، وأعد تعليقها في الوسط الخفيف أو الثقيل المقابل. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نيوباور. بعد ذلك ، قم بزرع سبعة ملايين خلية من كل مجموعة في طبق زراعة خلية مساحته 150 سم مربع.

قم بإعداد خمسة أطباق على الأقل لكل مجموعة من الخلايا الخفيفة والثقيلة. استزراع الخلايا في 30 مل من الوسط لكل طبق بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسيط ، واغسل الخلايا في 1X PBS.

افصل الخلايا في 1X PBS باستخدام مكشطة الخلية. بعد حساب كل من مجموعات الخلايا كما كان من قبل ، اسحب أعدادا متساوية للخلايا في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 ملليلترا. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 160 مرة جم وأربع درجات مئوية.

قم بإزالة PBS ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من السكروز العازلة. انقل تعليق الخلية إلى الخالط أوقية محكم قبل تحلل الخلايا ب 200 ضربة على الجليد. بعد ذلك ، انقل المحللة إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل ، وقم بتدوير النوى وحطام الخلية لمدة 10 دقائق عند 1،000 مرة جم وأربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، قم بتخزين 25 ميكرولترا من جزء ما بعد النووي ، أو PNS ، عند 20 درجة مئوية تحت الصفر كعنصر تحكم في الإدخال. ضع باقي جزء PNS في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي ، وقم بتغطيته بحوالي ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لغسل قطرات الدهون. جهاز طرد مركزي لمدة ساعتين عند 100 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، قم بحصاد جزء قطرات الدهون العائمة من أعلى الأنبوب باستخدام قنية حادة مثنية. بعد ذلك ، ضع جزء قطرة الدهون في أنبوب طرد مركزي ، وتراكب مع مخزن مؤقت لغسل قطرات الدهون ، وكرر خطوة الطرد المركزي. يتطلب حصاد قطرات الدهون من أعلى التدرج الخبرة.

ويكون الكسر أسهل كلما زاد الكسر. يمكنك استخدام الخلايا الدهنية للممارسة. أو يمكنك تغذية خلاياك بالأوليات لزيادة كمية قطرات الدهون.

مرة أخرى ، احصد جزء قطرات الدهون العائمة باستخدام قنية حادة منحنية من أعلى الأنبوب. انقل قطرات الدهون إلى أنبوب ميكروفيج جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول غسيل قطرات الدهون. بعد ذلك ، قم بتدوير العينة لمدة 20 دقيقة عند 21،000 مرة جم وأربع درجات مئوية.

قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الفرعي باستخدام طرف ماصة تحميل الهلام، وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات. بعد الإزالة النهائية لمخزن الغسيل ، امزج خمسة ميكرولترات من كسور قطرات الدهون مع 10 ميكرولترات من محلول التحلل NP 40 لتحديد محتوى البروتين. احتضان العينة على الجليد لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس إذا كنت تعمل بمواد معدية.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين كسور قطرات الدهون عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، امزج الحجم الذي يتوافق مع 35 ميكروغراما على الأقل من البروتين مع صبغة تحميل 4x. احتضان الخليط على الثلج لمدة ساعة لتعطيل الفيروس إذا كان يعمل بمواد معدية.

اغلي العينة على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإجراء SDS-PAGE متبوعا بتلوين Coomassie لإعداد العينة لزوجين من اللونيات السائلة لترادف الطيف الكتلي كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحليل نقاء قطرات الدهون ، قم بتخفيف حصص كسور قطرات الدهون ، من واحد إلى اثنين ، باستخدام المخزن المؤقت للتحلل NP 40.

قم بتخفيف كسور التحكم في الإدخال من واحد إلى عشرة بنفس المخزن المؤقت. احتضان العينات على الجليد لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع مواد معدية. بعد ذلك ، حدد مستوى البروتين باستخدام فحص البروتين المتوافق مع المنظفات.

بعد ذلك ، امزج كمية متساوية من البروتين مع 6x عينة مؤقتة ، واحتضن العينات على الثلج لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع مواد معدية. أخيرا ، تابع SDS-PAGE ، وانقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق نشاف الخزان عند 80 فولت لمدة 90 دقيقة. يظهر هنا تحليل لطخة غربية تمثيلية لكسور ما بعد النووية وقطرات الدهون.

تظهر اللطخة الغربية بوضوح إثراء أن بروتينات علامة القطرات الدهنية perilipin two و perilipin three في كسور قطرات الدهون ، واستنفاد علامات المقصورات الخلوية الأخرى. يمكن أيضا تحليل كسور ما بعد النووية والقطرات الدهنية عن طريق تلطيخ Coomassie الأزرق والفضي. توضح هذه الخريطة الحرارية عدد الببتيدات والنسبة المئوية لتغطية البروتين للبروتينات المحددة في كسور قطرات الدهون للخلايا التي تم تحليلها.

توضح الخريطة الحرارية النهائية كيف تغير عدوى فيروس التهاب الكبد C قطرة الدهون في اليوم. يشار إلى البروتينات المرتبطة بقطرات الدهون المخصبة باللون الأحمر ، ويشار إلى البروتينات المرتبطة بقطرات الدهون المستنفدة باللون الأزرق. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أننا نخلط الخلايا قبل العزل وعزل قطرات الدهون السابقة ، وبالتالي يمكننا تقليل الأخطاء التي يمكن أن تحدث أثناء تحلل الخلية وأثناء خطوات العزل.