الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

إن الهدف العام من عزل القطيرات الدهنية لغرض تحليل قياس الطيف الكتلي الكمي هو فهم وظيفة هذه العضيات، على سبيل المثال، في تكاثر مسببات الأمراض مثل فيروس التهاب الكبد C. ويمكن لهذه الطريقة أن تجيب على أسئلة رئيسية في مجال الأمراض المعدية، مثل سبب ارتباط مسببات الأمراض بالقطيرات من أجل التكاثر. ويمكن إتمام عملية عزل القطيرات الدهنية في غضون ست إلى سبع ساعات.

وخلال هذا الإجراء، من المهم تجنب تلوث الكيراتين. للبدء، قم بإزالة 50 milliliters من كل زجاجة من وسط DMEM وأضف 50 milliliters من مصل العجل الجنيني المدياليز. بعد ذلك، قم بإذابة 50 milligrams من الليسين المسمى بالكربون 13 و 50 milligrams من الأرجنين المسمى بالكربون 13 في one milliliter من الوسط.

امزج المكونات جيداً، ثم أضف الأحماض الأمينية إلى وسط DMEM المضاف إليه FCS. بعد ذلك، أضف PenStrep وبديل الجلوتامين. قم بترشيح الوسط تعقيمياً باستخدام مرشح بمسامية 0.45 micron، وضع ملصقاً على الزجاجة يشير إلى أنها وسط SILAC ثقيل.

لتحضير الوسط الخفيف، كرر هذه الخطوات باستخدام 50 milligrams من الأرجنين و50 milligrams من الليسين. ضع ملصقاً على الزجاجة بعنوان "وسط SILAC الخفيف". قم بمعالجة الخلايا بالتريبسين، ووزعها على بئرين في طبق زراعة مكون من ستة آبار.

يجب أن تحتوي إحدى الفجوات على 2 mL من وسط SILAC الثقيل، بينما تحتوي الأخرى على 2 mL من وسط SILAC الخفيف. تُزرع الخلايا لمدة ست ممرات على الأقل. بعد ست ممرات، يجب أن تتجاوز نسبة دمج الأحماض الأمينية الثقيلة 95%. يتم حصاد مليون خلية من المجموعات الخلوية الموُسّمة بالثقيل والخفيف لتحليل كفاءة الدمج.

بعد غسل الخلايا في 1X PBS، يتم تجميعها عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 160 ×g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية. أعد تعليق كتل الخلايا في 150 µL من MS-buffer. بعد ذلك، قم بحضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بتحلل الخلايا عن طريق الموجات فوق الصوتية عند درجة حرارة 4 °C. تخلص من حطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 11,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد، وحدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة بروتين متوافقة مع المنظفات.

بعد ذلك، اخلط 75 µg من البروتين مع 6x sample buffer. وبعد الغليان عند 95 °C لمدة خمس دقائق، افصل البروتينات باستخدام تقنية SDS-PAGE في SDS running buffer عند 180 V لمدة ساعة واحدة تقريبًا. وبعد التلوين بصبغة Coomassie، استأصل حزمة البروتين ذاتها وحلل كفاءة الدمج بواسطة تحليل MS.

قم بإصابة مجموعة الخلايا الخفيفة بفيروس التهاب الكبد C المراسل عن طريق تحضينها مع المخزونات الليفية لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. قم بتنمية الخلايا الخفيفة المصابة بـ HCV والخلايا الثقيلة غير المصابة كما هو موضح في البروتوكول النصي. في حال استخدام سلالة من HCV تحمل جين مقاومة البلاستيسيدين، أضف 10 micrograms per milliliter من blasticidin S إلى الوسط الخفيف لاختيار الخلايا الإيجابية لـ HCV.

قبل يوم واحد من عزل القطيرات الدهنية، اغسل الخلايا باستخدام PBS، ثم قم بهضمها باستخدام التريبسين، وأعد تعليقها في الوسط الخفيف أو الثقيل المناظر. قم بعد الخلايا باستخدام غرفة عد نيوباور. بعد ذلك، ازرع سبعة ملايين خلية من كل مجتمع خلوي في طبق زراعة خلايا بمساحة 150 سنتيمتراً مربعاً.

قم بتجهيز خمسة أطباق على الأقل لكل من مجموعة الخلايا الخفيفة والخلايا الثقيلة. ازرع الخلايا في 30 milliliters من الوسط الزرعي لكل طبق طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بإزالة الوسط الزرعي، واغسل الخلايا باستخدام 1X PBS.

قم بفصل الخلايا في 1X PBS باستخدام كاشط الخلايا. وبعد عد كلا المجموعتين الخلويتين كما سبق، اسحب أعداداً متساوية من الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 160 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius.

قم بإزالة PBS، وأعد تعليق كتلة الخلايا في 1 milliliter من محلول السكروز المنظم. انقل معلق الخلايا إلى مجانس Ounce محكم الإغلاق قبل تحلل الخلايا عن طريق إجراء 200 ضربة على الثلج. بعد ذلك، انقل المادة المتحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، وقم بترسيب النوى وحطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 minutes بسرعة 1,000 ×g وعند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم تخزين جزء قدره 25 µL من الكسر ما بعد النووي (PNS) عند درجة حرارة -20 °C كعينة تحكم للمدخلات. يُوضع باقي كسر الـ PNS في قاع أنبوب الطرد المركزي، ويُغطى بنحو 3 mL من محلول غسيل القطيرات الدهنية. ثم يُجرى الطرد المركزي لمدة ساعتين عند 100,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم جمع كسر قطيرات الدهون الطافي من أعلى الأنبوب باستخدام كانيولا غير مدببة ومثنية. بعد ذلك، ضع كسر قطيرات الدهون في أنبوب طرد مركزي، ثم غطِّه بمحلول غسيل قطيرات الدهون، وكرر خطوة الطرد المركزي. يتطلب جمع قطيرات الدهون من أعلى التدرج خبرة عملية.

ويصبح الأمر أسهل كلما كان الكسر أكبر. يمكنك استخدام الخلايا الدهنية للتدريب، أو يمكنك تغذية خلاياك بالأوليات لزيادة كمية القطيرات الدهنية.

مرة أخرى، قم بحصاد جزء قطيرات الدهون العائم باستخدام كانيولا غير مدببة ومنحنية من أعلى الأنبوب. انقل قطيرات الدهون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliliter، وأضف 500 microliters من محلول غسيل قطيرات الدهون. بعد ذلك، قم بتدوير العينة لمدة 20 دقيقة عند 21, 000 ×g ودرجة حرارة أربع degrees Celsius.

قم بإزالة منظم الغسيل الموجود بالأسفل باستخدام رأس ماصة تحميل الهلام، وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات. بعد الإزالة النهائية لمنظم الغسيل، اخلط 5 µL من كسور قطيرات الدهون مع 10 µL من منظم تحلل NP 40 لتقدير محتوى البروتين. قم بحضن العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس في حال العمل مع مواد معدية.

في هذه المرحلة، يمكن تخزين كسور قطيرات الدهون عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. بعد ذلك، اخلط الحجم الذي يقابل 35 µg على الأقل من البروتين مع صبغة التحميل بتركيز 4x. قم بحضن الخليط على الثلج لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس في حال العمل مع مواد معدية.

يُغلى sample عند 95 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم إجراء SDS-PAGE يليه صبغ Coomassie لتحضير sample من أجل liquid chromatogrophy couple to tandem mass spectronomy كما هو موضح في البروتوكول النصي. ولتحليل نقاء قطرات الدهون، تُخفف أجزاء من كسور قطرات الدهون، بنسبة 1 إلى 2، باستخدام NP 40 lysis buffer.

قم بتخفيف كسور التحكم المدخلة بنسبة من واحد إلى عشرة باستخدام المنظم نفسه. قم بحضن العينات على الثلج لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس في حال التعامل مع مواد معدية. بعد ذلك، حدد مستوى البروتين باستخدام مقايسة بروتينية متوافقة مع المنظفات.

بعد ذلك، اخلط كمية متساوية من البروتين مع محلول عازل للعينة (6x sample buffer)، وحضن العينات على الثلج لمدة ساعة واحدة لتعطيل الفيروس في حال العمل مع مواد معدية. وأخيراً، ابدأ في إجراء الفصل الكهربائي للهلام بـ SDS-PAGE، ثم انقل البروتينات إلى غشاء نيتروسليلوز عن طريق التلطيخ باستخدام الخزان (tank blotting) بجهد 80 فولت لمدة 90 دقيقة. يظهر هنا تحليل ممثل لطريقة "ويسترن بلوت" لكسور ما بعد النواة وقطيرات الدهون.

يظهر تحليل لطخة ويسترن (western blot) بوضوح إثراءً لبروتينات علامة القطرات الدهنية perilipin two وperilipin three في كسور القطرات الدهنية، ونضوباً لعلامات المقصورات الخلوية الأخرى. ويمكن تحليل كسور ما بعد النواة وكسور القطرات الدهنية بشكل إضافي باستخدام صبغة كوماسي الزرقاء (Coomassie blue) والصبغ الفضي. وتوضح الخريطة الحرارية هذه عدد الببتيدات ونسبة التغطية البروتينية للبروتينات التي تم تحديدها في كسور القطرات الدهنية للخلايا التي تم تحليلها.

توضح الخريطة الحرارية النهائية كيف يغير التهاب الكبد الفيروسي C (HCV) من طبيعة القطيرات الدهنية يومياً. ويُشار إلى البروتينات المرتبطة بالقطيرات الدهنية والمستنزفة باللون الأحمر، بينما يُشار إلى البروتينات المرتبطة بالقطيرات الدهنية والمنقوصة باللون الأزرق. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في قيامنا بخلط الخلايا قبل عملية العزل وقبل عزل القطيرات الدهنية، وبالتالي يمكننا تقليل الأخطاء التي قد تحدث أثناء تحلل الخلايا وأثناء خطوات العزل.