تحليل الكهربية من الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية (هسك-كمس) باستخدام صفائف متعدد القطب (مياس)
مايو 12, 2017
توصيف الكهربية من العضلية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية المحفزة (هسك-سمس) أمر بالغ الأهمية لنمذجة أمراض القلب وتحديد ردود المخدرات. ويوفر هذا البروتوكول المعلومات اللازمة لفصل و هسك لوحة-سم على صفائف متعدد القطب، وقياس إمكانات مجالها، وطريقة لتحليل كت وفترات ر.
الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ووضعها على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية لقياس وقياس مدة وتكرار إشارتها الكهربائية النموذجية التي تسمى أيضا إمكانات المجال. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في هذا المجال ، مثل ما هي الاختلافات الفيزيولوجية الكهربية بين خلايا عضلة القلب التي تحمل الطفرات والضوابط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفحص الأدوية على خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من خلايا المريض.
العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. نظرا لأن خطوات التفكك والطلاء ضرورية لتسجيل الإشارات الكهربائية بنجاح. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحديد الإشارات الكهربائية ذات الجودة الجيدة أو السيئة ليس تافها ويتطلب تحليل الإمكانات الحرة خبرة.
لبدء هذا الإجراء ، ضع الرقائق النظيفة في طبق بتري بلاستيكي معقم قياسي بقطر 10 سم. بعد ذلك ، أضف ثمانية ملليلتر من الماء المقطر المعقم إلى طبق بتري لتشكيل غرفة مرطبة ، مما يمنع الحجم الصغير لوسط الثقافة على الرقاقة من الرسم عند وضعه في الحاضنة. ثم استخدم حلقات PolyTetraFluoroEthylene المصنوعة خصيصا لضمان طلاء خلايا عضلة القلب في وسط الرقاقة حيث توجد مجموعة الأقطاب الكهربائية.
في غطاء محرك السيارة ، قم بإزالة الحلقات من الإيثانول. ضعيها في طبق بتري معقم بدون غطاء واتركي الحلقات تجف في الغطاء. ثم ضع حلقة جافة داخل شريحة MEA باستخدام ملاقط معقمة باللهب.
قم بتغطية الأقطاب الكهربائية بإضافة 50 ميكرولتر من 40 ميكروغرام لكل مليلتر من الفبرونيكتين داخل الحلقة. بعد ذلك ، قم بتغطية طبق بتري بالغطاء وانقل الطبق الذي يحتوي على شريحة MEA بعناية إلى حاضنة. بعد ذلك ، انقل الطبق الذي يحتوي على شريحة MEA إلى غطاء مزرعة الخلية.
قبل استخدام شريحة MEA ، قم بشفط 50 ميكرولتر من الفيبرونيكتين باستخدام ماصة P200 أو نظام تفريغ في الغطاء دون إزاحة حلقة PTFE. تأكد من عدم لمس أي أجسام صلبة للأقطاب الكهربائية عن طريق الحفاظ على الطرف بزاوية. ثم أضف برفق 950 ميكرولتر من وسط LI-BPEL ، مع التأكد من توزيعه بالتساوي وعدم طفو الحلقة.
بعد ذلك أعد الطبق إلى الحاضنة. هذه هي الثقافة الأولية لخلايا عضلة القلب النابضة. في غطاء مزرعة الأنسجة ، استنشق الوسط من ثقافة hPSC-CMs جيدا.
أضف ملليلترا إلى ملليلترين من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى كل بئر لغسل الثقافة وشفط PBS. بعد ذلك ، أضف 500 لتر صغير من إنزيم التفكك إلى كل بئر. احتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
بعد خمس دقائق ، أضف ملليلترا واحدا من LI-BPEL إلى كل بئر لتخفيف الإنزيم. افصل الطبقة الأحادية من hPSC-CMs عن طريق خدشها برفق باستخدام ماصة P1000. ثم اجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 مل.
بعد ذلك ، اشطف البئر بملليلتر واحد من LI-BPEL لجمع جميع الخلايا المتبقية وكتل الخلايا. أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات أخرى من LI-BPEL للوصول إلى الحجم النهائي من حوالي خمسة إلى ستة ملليمترات وقم بالماصة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر لفصل كتل الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق عند 300 مرة جرام.
بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزاحة بيليه الخلية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 250 ميكرولتر من LI-BPEL. قم بعد ذلك بتوزيع 50 ميكرولترا من تعليق الخلية لكل MEA عن طريق وضع تعليق الخلية مباشرة في مركز حلقة PTFE أعلى مجموعة الأقطاب الكهربائية.
انقل المتوسطات البيئية بعناية إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية واترك الخلايا تلتصق طوال الليل. بعد يوم واحد من الطلاء ، قم بإزالة الحلقة بعناية في بيئة معقمة باستخدام ملاقط معقمة. اشطف الحلقة بنسبة 80 بالمائة من الإيثانول.
وتخزينه في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 80 في المائة من الإيثانول الطازج. بعد ذلك ، قم بإزالة 500 لتر ميكرو من الوسط برفق من شريحة MEA. وأضف 500 لتر ميكرو من LI-BPEL الطازج إليها.
هذه هي خلايا عضلة القلب النابضة بعد إزالة الحلقة. بعد ذلك ، قم بنقل MEAs إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية. ثم قم بقياس النشاط الكهربائي ل hPSC-CMs على المتوسط البيئي بدءا من يوم واحد بعد إزالة الحلقة وحتى أسبوع واحد.
الآن قم بتشغيل مجموعة البرامج المرتبطة بإعداد MEA. بعد ذلك ، اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية في TCX-Control لتسجيل القياسات. بعد ذلك ، قم بإزالة الطبق الذي يحتوي على شريحة MEA من الحاضنة.
أخرجي شريحة MEA من الطبق وضعيها على منديل لامتصاص الماء المتبقي. امسح السياق الخارجي للوحة بعناية بمنديل ورقي ونظفه باستخدام قطعة قطن مبللة بالإيثانول بنسبة 100 في المائة لإزالة أي ماء متبقي أو حطام قد يسبب ضوضاء الإشارة. ثم انقل لوحة MEA إلى مرحلة رأس تسجيل 37 درجة مئوية للكشف عن النشاط التلقائي.
افتح MC Rack وانقر فوق تحرير لتحميل أجهزة MEA. لإنشاء بروتوكول جديد ، استخدم تحرير القائمة المنسدلة لإضافة مسجل مختلف ونوافذ عرض إلى البروتوكول. ابدأ البروتوكول بعد ذلك في وضع التشغيل بالنقر فوق زر التشغيل.
إذا أظهرت الإشارات قمم R مرئية وقمم T بوضوح ، فانتظر من 10 إلى 15 دقيقة لإنهاء مرحلة التكيف. لبدء التجربة، انقر فوق تسجيل ثم تشغيل البيانات والحصول عليها لمدة 10 دقائق في ظل ظروف خط الأساس لتحديد الحالة المستقرة. على الأقطاب الكهربائية التي تحتوي على أفضل إشارة بحيث يمكن التعرف عليها بسهولة وتصديرها لاحقا لتحليلها.
لتقييم الاستجابة للأدوية، أضف تركيزات متزايدة من الدواء كل 10 دقائق. انقر فوق إيقاف لإنهاء التسجيل في نهاية البروتوكول. فيما يلي الآثار التمثيلية المسجلة مع MEA التي تظهر تتبعا عالي الجودة مع قمم RQ و T مرئية بوضوح مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء.
تتبع جودة سيئة بدون قمم RQ و T مرئية بوضوح وأثر صاخب مع قمم RQ و T مرئية بوضوح ولكن مع نسبة إشارة منخفضة إلى الضوضاء. وفيما يلي أمثلة تمثيلية لآثار إمكانات المجال عالية الجودة مع أشكال مختلفة يمكن تسجيلها أثناء تجارب MEA باستخدام hPSC-CMs. تمثل المنطقة المظللة فاصل QT المقاس أثناء التحليل.
نظرا لأن جهد المجال في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا يشبه المشتق الأول لجهد الفعل ، فقد تم حساب تكامل آثار جهد المجال كعروض نظرية للموجات T القريبة من إعادة استقطاب جهد الفعل الكامل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الذهاب إلى أكبر عدد من الأقطاب الكهربائية لضمان إشارات موثوقة ومتسقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل PCR لوقت الظنبوب الكمي أو مشبك تصحيح الخلية المفردة للإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير الجيني المحدد المتعلق بالنمط الظاهري الكهربائي أو كثافة التيار الأيوني المحددة.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخلايا الجذعية ، لاستكشاف عدم انتظام ضربات القلب وعلم الأدوية في المختبر باستخدام خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل الخلايا العضلية الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية ووصفحها في MEAs لقياسات الفيزيولوجيا الكهربية وفحص الأدوية. لا تنس أن العمل مع الأدوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل GLP القياسي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول عملية تفكيك وزراعة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSC-CMs) على صفائف الأقطاب الكهربائية المتعددة (MEAs) من أجل التوصيف الكهربائي الفسيولوجي. يوضح الطرق المستخدمة لقياس المجال المحتمل وتحليل فترات QT و RR، وهي ضرورية لنمذجة الأمراض القلبية وتقييم استجابة الدواء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- فحص الأدوية
الخلفية
- فهم الخصائص الكهربائية الفسيولوجية لـ hPSC-CMs أمر حيوي للبحث في القلب.
- تتيح هذه الطريقة تقييم استجابات الدواء في الخلايا العضلية القلبية البشرية.
- توفر قياسات المجال المحتمل رؤى حول النشاط الكهربائي الخلوي.
- العرض البصري للبروتوكول أمر بالغ الأهمية لنجاح التنفيذ.
هدف الدراسة
- لتوصيف الإشارات الكهربائية لـ hPSC-CMs.
- لمقارنة الاختلافات الكهربائية الفسيولوجية بين الخلايا العضلية القلبية الطافرة والخلايا العضلية القلبية للتحكم.
- لتسهييل فحص الأدوية باستخدام الخلايا المشتقة من المرضى.
الطرق المستخدمة
- تفكيك hPSC-CMs باستخدام إنزيم التفكيك.
- زراعة الخلايا على MEAs مع طلاء الفيبرونيكتين.
- قياس النشاط الكهربائي باستخدام برامج متخصصة.
- تقييم استجابات الدواء عن طريق تغيير تركيزات الدواء أثناء التسجيلات.
النتائج الرئيسية
- تفكيك وزراعة ناجحتين لـ hPSC-CMs على MEAs.
- قياس واضح للمجالات المحتملة وتحديد قمم R و T.
- القدرة على تقييم استجابات الدواء في الوقت الحقيقي.
- تبين جودة الإشارة المتفاوتة بناءً على الظروف التجريبية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة hPSC-CMs.
- التوصيف الكهربائي الفسيولوجي ضروري لفهم الأمراض القلبية.
- تدعم الطريقة جهود فحص الأدوية في الطب الشخصي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Electrophysiological profiling of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) using multi-electrode arrays (MEAs) enables medium- to high-throughput assessment of cardiac ion channel function and drug-induced electrophysiological changes. This approach supports early detection of cardiotoxic liabilities and mechanistic de-risking of arrhythmogenic compounds in discovery-stage screening. By providing quantitative field potential parameters such as QT and RR intervals, the method enhances predictive confidence in translational cardiovascular research and safety pharmacology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing electrophysiological phenotypes between mutant and control hPSC-CMs to clarify ion channel dysfunction mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of cardiac ion channel targets using human-relevant cellular models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that prolong QT interval or alter field potential morphology, indicating pro-arrhythmic risk.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated hPSC-CM monolayers on MEAs for consistent, reproducible field potential recording across multiple electrodes.
- Quantitative Output: Enables extraction of interval-based metrics (QT, RR) and waveform morphology as dependable readouts for compound effect assessment.
- Scalability & Reuse: Supports medium-throughput drug response profiling with dose-response capability, enabling reuse across screening campaigns and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Uses hPSC-CMs derived from patients with arrhythmia syndromes to model human cardiac electrophysiology in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase electrophenotyping with preclinical validation by providing human-derived data predictive of in vivo drug responses.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of ion channel-mediated effects early, reducing late-stage attrition due to cardiac safety findings.
Pipeline & Workflow Integration
The MEA-based electrophysiological assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, enabling data-driven decisions at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel involvement in arrhythmia mechanisms by measuring field potential changes in genetically defined hPSC-CMs.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible electrophysiological readouts with temperature-controlled, automated signal acquisition for compound library profiling.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (QT, RR intervals, waveform morphology) that enable objective comparison of electrophysiological states across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro electrophenotyping to clinical relevance by modeling human cardiac electrophysiology and drug response in a scalable format.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable across multiple projects, targets, and therapeutic areas in cardiovascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology through direct human cell-based measurement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled plating, coating, and environmental conditions, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of cardiotoxic compounds, thereby reducing late-stage biological risk and capital inefficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying electrophysiological liabilities early, informing resource allocation toward safer candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, cardiac differentiation, and electrophysiological signal interpretation to ensure data quality.
- Dependent on MEA-compatible instrumentation, temperature control units, and signal acquisition software for reliable field potential recording.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation, plating density, and analysis protocols to ensure comparability across studies.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D cultures or alternative maturation states of hPSC-CMs to maintain signal fidelity.
- Limited by the need for optimization of dissociation and plating conditions to avoid cellular stress that could confound electrophysiological readouts.
