وهناك طريقة غير الغازية لعزل والنمط الظاهري الخلايا من الملتحمة

الهدف العام من تقنية علم الخلايا الانطباعية هذه هو اشتقاق خلايا كافية للنمط الظاهري للخلايا المشاركة في أمراض سطح العين مناعيا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال سطح العين ، مثل الخلايا المناعية المهمة لالتهاب سطح العين. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها غير جراحية نسبيا وسهلة الأداء في العيادة والمختبر.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الاضطرابات الالتهابية لسطح العين لأنها تسمح بتحديد مجموعات معينة من الخلايا المناعية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لمجموعة الخلايا المناعية على سطح العين. يمكن تطبيقه أيضا على التحقيق في علم السموم العينية وتليف العين.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب نقص الخبرة في التعامل مع العدد المنخفض من الخلايا التي تم جمعها من العين. بعد تحديد الحالة السريرية للمشارك ، ضع قطرة أو قطرتين من التخدير الموضعي على البصلي العلوي والثقب السفلي لعيون المشارك. انتظر من أربع إلى خمس دقائق حتى يزول الإحساس بالوخز الناتج عن التخدير.

ثم ضع جهاز علم الخلايا الانطباعي بشكل عرضي على التخمين على جانب البصيلة الصدغية واضغط برفق مع الاستمرار على زر الضغط لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان. باستخدام الملقط ، قم بتحرير غشاء العين الذي تم حصاده في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على مليلتر واحد من وسط الاستزراع متبوعا بدقيقة واحدة من الكشط المستمر للغشاء بطرف ماصة سعة 10 ميكرولتر لاستعادة بقية الخلايا من الجهاز. كن حذرا عند كشط الغشاء ، لأن الكثير من الكشط سيؤدي إلى مزيج من الحطام ، في حين أن القليل جدا من الكشط يمكن أن يؤدي إلى انخفاض استخدام الخلايا.

عندما يصبح سطح الغشاء غير مستو ، كرر مجموعة ثانية من نفس العين على الجانب الأنفي من العين ، كما هو موضح للتو. اسحب الخلايا بتعليق عينة العين الأول واجمع عينتين من عين المشارك الأخرى. في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات من التجميع ، قم بالطرد المركزي لخلايا العين وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من Flow Cytometry Staining Buffer ، الذي يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات مكمل بنسبة 0.05٪ من ألبومين مصل الأبقار.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا بلوحة من الأجسام المضادة ذات الأهمية لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلوين وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مخزن التلوين الجديد. قم بمعايرة جهد قناة مقياس التدفق الخلوي في لوحة إعداد مقياس الخلايا وقم بإعداد أنبوب من حبات التتبع لتطبيع الحصول على البيانات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد ذلك ، في برنامج جمع بيانات Flow Cytometry ، انقر فوق إعداد مراقبة الجودة واختر إعداد مقياس الخلايا الصحيح وتتبع رقم دفعة الخرزة. قم بتحميل الخرزات وانقر فوق الزر "ابدأ". الآن ، أعد تعليق تعليق الخلية بنقرة لطيفة وقم بتحميل الأنبوب على الجهاز.

افتح برنامج جمع البيانات وانقر فوق معاينة. عندما يكون معدل الحد مستقرا، انقر فوق اكتساب. راقب مستوى العينة، وانقر فوق إيقاف عند نفاد العينة.

بعد الحصول على 10,000 حدث ، قم بإنشاء مخطط نقطي لمنطقة التشتت الأمامية جنبا إلى جنب واستخدم أداة بوابة المضلع لرسم مجموعة سكانية بوابة واحدة فوق جميع الأحداث بقيمة منطقة تشتت أمامية أكبر من خمسة في 10 إلى الرابع لاستبعاد الحطام. انقر فوق إنشاء مخطط نقطي لإنشاء مخطط نقطي جديد. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرة واختر خصائص لفتح نافذة محرر المؤامرة.

أختر P1 وانقر فوق منطقة التشتت الأمامية على المحور x لتغيير المحور المعروض إلى CD3. افتح مخططا نقطيا جديدا لمجموعة P2 وقم بتغيير المحور x إلى 7-AAD. ارسم بوابة حول السكان السلبيين 7-AAD لتحديد الخلايا الإيجابية CD3 القابلة للحياة.

قم بتسمية هذه البوابة P3 وافتح مخططا نقطيا جديدا. في نافذة محرر المؤامرة ، حدد CD3 للمحور x و CD4 للمحور y. استخدم الآن مجموعات P4 و P5 لفتح مخططين نقطيين جديدين وتعيين المحاور x لعرض الخلايا الموجبة CD45RO والمحاور y لعرض الخلايا الموجبة CCR7 في كل مخطط.

ثم قم بإنشاء بوابة P6 حول الخلايا الإيجابية CD3 ، و CD4 الإيجابية ، و CCR7 ، و CD45RO الموجبة ، وبوابات P7 و P8 و P9 حول الخلايا الإيجابية CD3 ، و CD4 السلبية ، و CCR7 الإيجابية ، و CD45RO الإيجابية. CD45RO سلبية ، CCR7 سلبية ، CD4 سلبية ، خلايا CD3 موجبة و CD45RO إيجابية ، CCR7 سلبية ، CD4 سلبية ، خلايا CD3 إيجابية ، على التوالي. يمكن وصف المجموعات السكانية الإيجابية CD4 و CD4 السلبية بأنها خلايا CD45RO إيجابية ، CCR7 إيجابية ، خلايا ذاكرة تائية مركزية ، CD45RO إيجابية ، خلايا ذاكرة مستجيب سلبية CCR7.

و CD45RO سلبية ، CCR7 سلبية ، T متمايزة نهائيا وفقا لتعبير علامة CCR7 و CD45RO. من بين هذه المجموعات الفرعية ، تعد خلايا الذاكرة التائية الإيجابية CD4 و CD8 الإيجابية ، المجموعة الفرعية الرئيسية للخلايا التائية التي يتم ملاحظتها عادة على سطح العين للبشر الأصحاء. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة ذلك ، يمكن إجراء إجراءات أخرى مثل ELISA و Western blot ودراسات أخرى للإجابة على أسئلة إضافية حول السيتوكينات والجينات المشاركة في مسار الإشارة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال دراسات سطح العين لتقييم أنواع الخلايا المناعية المختلفة ضمن مجموعة ديموغرافية معينة من المريض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء علم الخلايا الانطباعية وكيفية عزل الخلايا المناعية ومعالجتها من سطح العين.