A المناعة الذاتية الجفاف العين الفئران نموذج مع زيادة في المفعول الذاكرة خلايا T في الأنسجة مقلة العين

الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث السمات السريرية لضعف الدموع والتهاب الغدد الدمعية في الفئران باستخدام التحصين تحت الجلد وحقن الغدة تحت الملتحمة وداخل الدمعية لمستخلصات الغدة الدمعية لتقييم العلاجات في العين الجافة المناعية الذاتية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في جفاف العين ، مثل ما إذا كانت الأدوية التي تثبط الخلايا التائية في أمراض المناعة الذاتية فعالة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية ، أنها تنتج علامات أمراض العين المشابهة لجفاف العين البشرية وتحدد أيضا الخلايا التائية التي تتسلل إلى الغدة الدمعية والعين.

تمتد الآثار المترتبة على هذا النموذج الحيواني نحو فهم الاتجار بالخلايا الليمفاوية لأنه يمكن دراسة الطحال والغدد الليمفاوية. بشكل عام ، سوف يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب عدم وجود أجهزة مناسبة لتوثيق التغييرات في عين الجرذ الصغيرة. يعد العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات معينة بسبب الجفاف السريع لعين الجرذ وعدم وجود وميض بعد التخدير.

بعد القتل الرحيم لأنثى فأر Sprague Dawley وفقا لبروتوكول النص ، ضع بشكل مسطح مع وجود أذن واحدة على الطاولة والأخرى متجهة لأعلى. باستخدام مقص ، قم بعمل شق 10 ملم متفوق أدنى تحت الأذن المكشوفة. ثم قم بإزالة الغدة الدمعية عن طريق تشريحها من النسيج الضام المحيط ومن قناة التصريف.

بعد ذلك ، باستخدام المقص ، قم بفرم الأنسجة بأكبر قدر ممكن من النعومة على الجليد. ثم أضف 150 ميكرولترا من PBS مع مثبط إنزيم البروتياز 1X لكل غدة دمعية. مع ضبط الصوتنة على 10 ثوان ، و 10 ثوان ، و 30٪ السعة ، قم بصوتنة العينات على الجليد عند 20 كيلو هرتز لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات الصوتية عند 13 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، قم بتقطيع المادة الطافية إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

انقل مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من المتفطرة السلية H37Ra أو مساعد فرويند غير المكتمل إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، مما يضمن أن حجم المادة المساعدة لخليط المستضد بنسبة واحد إلى واحد. أضف خليط المستضد الذي يحتوي على ملليغرامين لكل مليلتر من البيضافات و 10 ملليغرام لكل مليلتر من مستخلص الغدة الدمعية قطرة قطرة قطرة إلى المحلول المساعد أثناء الدوامة بأعلى سرعة لا تؤدي إلى انسكاب. استمر في الدوامة لمدة خمس دقائق بعد إضافة كل المستضد.

انقل المستحلب إلى حقنة سعة خمسة ملليلتر ، واستخدم موصل حقنة لربطه بحقنة أخرى سعة خمسة ملليلتر. ثم ادفع المستحلب من حقنة إلى أخرى لخلطها. في اليوم صفر ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من المستحلب ، الذي يحتوي على ملليغرام واحد من مستخلص الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيضا في مساعد فرويند الكامل ، في محاقن قفل Luer ملليلتر واحد ، وقم بتجهيز المحاقن بإبر قياس 27.

بدون استخدام التخدير ، قم بحقن المستحلب تحت الجلد في قاعدة ذيول الفئران. ثم ، في اليوم 14 ، بطريقة مماثلة ، قم بحقن 200 ميكرولتر من نفس المستضد في مساعد فرويند غير المكتمل. في نفس اليوم ، قم بحقن 300 نانوجرام من سم السعال الديكي داخل الصفاق في 100 ميكرولتر من PBS.

في اليوم 48 ، قم بوزن الكمية المطلوبة من البيضا وقم بإذابتها في PBS. بعد ذلك ، امزج البيضافيالبومين مع مستخلص الغدة الدمعية المذابة المحضر سابقا في هذا الفيديو ، مما يجعل محلول المستضد يحتوي على ملليغرام واحد لكل مليلتر من البيضافي ومليغرام واحد لكل مليلتر من مستخلص الغدة الدمعية. بعد تخدير الفئران ، قم بحقن خمسة ميكرولترات من المستضد في الملتحمة تحت الملتحمة القبيلة للعين.

ثم حقن 20 ميكرولترا من المستضد في الغدة الدمعية. أثناء حمل فأر مخدر وفقا لبروتوكول النص ، لقياس حجم المسيل للدموع بخيط أحمر الفينول ، استخدم زوجا واحدا من الملقط لتثبيت الخيط وآخر لسحب الجفن السفلي للفئران. ضع الخيط في الزاوية القريبة من القب السفلي لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بإزالة الخيط.

بعد ذلك ، ضع الخيط بجوار المسطرة بعلامات ملليمترية ، والتقط صورة لطول الجزء المبلل من الخيط. لقياس نعومة تمزق القرنية ، ضع الجرذ تحت مجهر استريو مزود بإضاءة حلقية وكاميرا. ثم ضع خمسة ميكرولترات من المحلول الملحي على قرنية الفئران.

باستخدام أصابع القفازات ، رمش بشكل سلبي عن طريق تحريك الجفون العلوية والسفلية خمس مرات تقريبا لنشر المحلول الملحي. أقل من 1.6 مرة من التكبير ، ركز مصباح الحلقة على منتصف سطح القرنية. ثم ، بعد 10 ثوان ، احصل على صور فوتوغرافية.

استخدم مسح الفلورسين لقياس تلف القرنية عن طريق إضافة ميكرولترين من 0.2٪ فلورسين إلى قرنية الفئران. بإصبع يرتدي قفازا ، افتح وأغلق جفون الفئران بشكل سلبي ثلاث مرات لنشر صبغة الفلورسين على سطح العين. بعد دقيقة واحدة ، استخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لسحب مليلتر واحد من المحلول الملحي.

بعد ذلك ، ضع المحقنة على بعد حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات أمام القرنية وقم بتطبيق المحلول الملحي برفق على العين. مع إطفاء ضوء الخلفية ، احصل على صور تحت المرشح الأزرق الكوبالت لمجهر تصوير العين. بعد القتل الرحيم للفأر وفقا لبروتوكول النص ، استخدم المقص لإزالة الجفون العلوية والسفلية.

حرر الكرة الأرضية عن طريق قطع العضلات خارج العين والعصب البصري والملتحمة القبية. قم بعمل شق لفتح مقلة العين. قم بإزالة العدسة في الجسم الزجاجي.

ثم ضع مقل العيون المقطوعة في أنابيب سعة 1.5 مليلتر على الجليد. أخيرا ، اجمع الغدد الدمعية كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. يوضح هذا الشكل صورا تمثيلية لخيوط الفينول الحمراء من الفئران الضابطة و DED.

طول خيوط الفينول الحمراء في مجموعة DED أقصر من المجموعة الضابطة ، مما يشير إلى حجم أقل للدموع. يرتبط الفلورسين بظهارة القرنية التالفة وبالتالي يستخدم لقياس مدى الضرر. في هذه التجربة ، تم تصنيف بقع الفلورسين على سطح القرنية لفئران DED من صفر إلى اثنين ومقارنتها بالفئران الضابطة.

الفئران المصابة ب DED لديها تلطيخ بالفلورسين أكثر من الفئران الضابطة ، مما يشير إلى تلف القرنية. كما هو موضح هنا ، إذا كان سطح القرنية أملسا مع ثبات تمزق عال ، فإن صورة حلقة الإضاءة على سطح العين مستديرة ومثالية. يشير تشويه الصورة إلى انخفاض نعومة القرنية وغشاء دمعي غير مستقر ، كما لوحظ بدرجة تشويه أعلى في مجموعة DED.

يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي هذا أن المجموعة الفرعية للخلايا التائية السائدة في أنسجة مقلة العين الطبيعية للفئران هي الخلايا التائية الذاكرة المستجيبة. في مقل عيون الفئران DED ، ما يقرب من 70٪ من الخلايا التائية الإيجابية CD3 هي خلايا تائية للذاكرة المستجيبة بينما في الفئران الضابطة يبلغ هذا الرقم حوالي 50٪ مقل عيون الفئران DED لديها خلايا تائية للذاكرة المستجيبة أعلى بكثير من تلك الموجودة في الفئران الضابطة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تلطيخ لأنواع أخرى من الخلايا المناعية للإجابة على أسئلة إضافية.

على سبيل المثال ، يمكنك تلطيخ الخلايا المناعية الفطرية أو الخلايا الليمفاوية البائية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لفهم مناعة سطح العين ، علاوة على ذلك ، لدراسة جفاف العين لدى البشر ومتلازمة شوغرن. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث جفاف العين المناعي الذاتي في الفئران وإجراء توثيق قوي للنتائج.