الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

يظهر هذا البروتوكول كيفية استئصال باستمرار عيون مستورقة (أكواب البصرية) من دون إزعاج الأنسجة المحيطة بها. باستخدام إبرة الأنسولين والمحاقن، إما احدة أو كلتا العينين يمكن أن يكون ذاب لتسهيل التحقيقات في آليات تنظيم التجديد العين، وتطور تجديد البصري، والأساس العصبي للسلوك الناجم عن الضوء.

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إزالة الكوب البصري المستوي بشكل موثوق دون إزعاج الدماغ أو الأنسجة المحيطة بحيث يمكن تنفيذ هذه التقنية من قبل الباحثين والطلاب في جميع مستويات التعليم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التجديد، مثل تحديد الآليات التي تنظم صيانة الخلايا الجذعية للعين الذاتية وتمايزها في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بإزالة أنسجة العين فقط مع الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة الأخرى.

بشكل عام ، يلزم الممارسة قبل أن يتمكن الأفراد الجدد في هذه الطريقة من إزالة الكمية الصحيحة من الأنسجة بشكل موثوق ، واستئصال العين بأكملها مع تجنب استئصال الأنسجة المحيطة. للبدء ، اختر الديدان التي لم يتم إطعامها لمدة أسبوع واحد على الأقل ويبلغ طولها من خمسة إلى سبعة ملليمترات على الأقل. انقل 15 إلى 30 دودة إلى طبق بتري 100 ملم مليء بثلثي الماء الدودي واستبدل الغطاء على الفور.

راقب الديدان بحثا عن الأنسجة المفقودة أو غير المصطبغة ، مثل الرؤوس البيضاء أو الذيل ، للتأكد من أنها غير تالفة وليست متجددة مؤخرا. أولا ، امسح مساحة العمل وقاعدة المجهر التشريح بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ ، واتركه يجف تماما. ضع الطبق مع الديدان المحددة على الجانب الأيسر من المجهر.

بعد ذلك ، على الجانب الأيمن من المجهر ، ضع زوجا من الملقط رقم خمسة ، وإبرة أنسولين مقاس 31 بوصة 5/16 بوصة مع حقنة سعة مليلتر واحد ، وماصة نقل نظيفة ، وصفيحة ذات 12 بئرا لجمع الديدان المفصلة. ضع صندوقا من مناديل المناديل المبللة الخالية من النسالة ، وزجاجة غسيل بلاستيكية مملوءة بماء الديدان العذب ، وماصات نقل إضافية بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة أثناء الجراحة. ضع لوحة بلتيير في وسط قاعدة المجهر التشريح ، واضبط الإخراج على مصدر طاقة التيار المستمر بحيث يكون سطح لوحة بلتيير باردا بدرجة كافية لشل حركة الديدان.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طبق بتري مملوء بالثلج بدلا من طبق بلتيير. لتحضير سطح الجراحة ، قم أولا بقص قطعة من فيلم البارافين البلاستيكي بحجم خمسة سنتيمترات في عشرة سنتيمترات وضعها فوق منتصف لوحة بلتييه. بعد ذلك ، قم بطي منديل منحل خال من النسالة في مربع يبلغ طوله حوالي سنتيمترين ، وضعه فوق الفيلم.

بعد ذلك ، أمسك المنديل المطوي في مكانه ، وقم بترطيبه بالماء الدودي ، ولف المنديل بشكل مسطح بماصة نقل. أخيرا ، قم بقص قطعة من ورق الترشيح الأبيض من 1.5 إلى سنتيمترين مربعين ، وضعها فوق المسح. لبدء الجراحة، ضع جانبا ظهريا واحدا من الدودة لأعلى على ورق الترشيح، باستخدام ماصة النقل.

قم بتشغيل الضوء وتركيز شعاعه على الدودة. اضبط تركيز مجهر التشريح والتكبير بحيث تكون عيون الدودة مرئية بوضوح. قم بتدوير فيلم البارافين لضبط موضع الدودة بحيث يتم توجيه رأسها نحو الباحث وزاوية 30 إلى 40 درجة إلى اليمين.

إذا تم وضع الدودة في الجانب البطني متجها لأعلى ، وكانت فتحة البلعوم مرئية ، فاستخدم الجانب الباهت من الملقط لتغيير موضع الدودة برفق إلى الجانب الظهري لأعلى مع رؤية العينين. أعد ضبط إعدادات المجهر بحيث تكون العينان في بؤرة التركيز بوضوح. تأكد أيضا من أن كل من العينين وأنسجة الرأس المحيطة بها في الرؤية.

أمسك حقنة نظيفة في اليد اليمنى بين الإبهام والسبابة. ادعم الجزء السفلي من المحقنة على الإبهام الأيسر ، مستعدة ضد لوحة بلتيير. انظر من خلال المجهر للتأكد من أن شطبة الإبرة مرئية.

ضع السبابة اليسرى على سطح الجراحة بحيث يصنع زاوية 40 درجة بالإبهام الأيسر لضمان بقاء السطح مستقرا أثناء العملية. ضع الإبرة بزاوية 90 درجة على العين مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى. باستخدام طرف الإبرة ، اخترق برفق الطبقة الرقيقة من الأنسجة التي تغطي الكوب البصري للعين المرئية على شكل منطقة بيضاء غير مصبوغة.

اغرف من اليمين إلى اليسار ، قم بإزالة أي أنسجة سوداء مصطبغة موجودة داخل الكوب البصري وكذلك جميع الأنسجة البيضاء. في حالة إجراء استئصال العين المزدوجة ، قم باستئصال العين الثانية الآن. بعد الانتهاء من الجراحة، قم بإعادة تحميل الماصة بكمية صغيرة من ماء الدودة، وحرر الماء على الدودة لرفعها من ورق الترشيح.

اسحب الدودة على الفور إلى ماصة النقل. انقل الدودة إلى صفيحة ذات 12 بئرا مليئة بالثلثين بمياه الدودة العذبة. بمجرد نقل جميع الديدان ، اغسلها عن طريق استبدال المياه من الآبار بمياه الديدان العذبة.

احتضان الديدان المحمية من الضوء في حاضنة 20 درجة مئوية ومراقبة عملية التجديد. للتضحية بالديدان الحية ، قم بإزالة ماء الدودة من اللوحة واستبدله بنسبة 70٪ من الإيثانول. احتضن الديدان لمدة ثلاث إلى خمس دقائق ولاحظ ما إذا كانت الديدان تتحلل وتتحول إلى اللون الرمادي.

تظهر هنا صور للديدان المفلطحة التي تعرضت لاستئصال العين المزدوجة واستئصال العين الواحدة ، تم التقاطها قبل العملية الجراحية وبعدها بأربعة أيام وأسبوعين. توضح الصور تقدم التجديد بمرور الوقت. تم تأكيد تجديد العين في الديدان المستعصصة أيضا من خلال التلوين الكيميائي المناعي للاستقال والخلايا العصبية المستقبلة للضوء المطورة حديثا.

تمت دراسة استعادة النظام البصري في الديدان المفلطحة بعد استئصال العين المزدوجة أيضا في اختبار وظيفي يعتمد على الاستجابة الورهية للضوء من النوع البري للضوء. بعد 24 ساعة من الاستئصال ، لا تتجنب الديدان عديمة العين الضوء وتنتقل عبر البقع الضوئية. يتم استعادة رهاب الضوء بعد سبعة أيام من العملية ، مما يشير إلى أن النظام البصري المتجدد يعمل.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء استئصال العين المزدوجة لدودة واحدة حوالي ثلاث دقائق. عند الاستئصال ، من المهم استئصال جميع أنسجة العين المصطبغة وغير المصطبغة ، مع التأكد من عدم إتلاف الأنسجة بين العينين أو تمزيق الأنسجة لاحقا في العين. بعد هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية وتداخل الحمض النووي الريبي من أجل فحص دور جينات معينة وعملية تجديدها.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء فحوصات سلوكية لاختبار وظائف العين بعد إعادة النمو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استئصال العيون المستوية دون إزعاج الأنسجة المحيطة. لا تنس أن العمل بالإبر يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وإمساك الإبرة بعيدا عنك.