الجهد المشبك فلوروميتري في

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال حمض أميني غير طبيعي فلوري في بروتين غشائي يتم التعبير عنه في بويضات Xenopus، وتحديد وظيفة البروتين وإعادة ترتيبه الهيكلي في آن واحد، باستخدام قياس الفلورية بتثبيت الجهد. ستساعد هذه التقنية في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلاقات بين البنية والوظيفة للبروتينات الغشائية. وباستخدام قياس الفلورية بتثبيت الجهد، يمكننا الربط مباشرة بين إعادة الترتيب الهيكلي ووظيفة البروتين.

يساعد إضافة وسم الأحماض الأمينية غير الطبيعية الفلورية في التغلب على القيود السابقة المتعلقة بالوسم. كانت هذه القيود تتمثل في إمكانية الوصول إلى مواقع الوسم، بالإضافة إلى الوسم الخلفي الناتج عن مواقع الارتباط الداخلية. ويمتد أثر هذه التقنية نحو فهم فيزيائي حيوي أفضل لبروتينات الغشاء، حيث أصبح بإمكانك الآن سبر أغوار النطاقات التي كانت في السابق غير قابلة للوصول باستخدام قياس الفلورية التقليدي بجهد تثبيت الغشاء.

بعد الإزالة الجراحية للبويضات من ضفدع Xenopus، تُغسل البويضات ثلاث مرات بمحلول SOS. يتم اختيار البويضات الكبيرة والسليمة بشكل فردي، وتُحضن عند درجة حرارة 18 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل في محلول Barth المدعم بالمضادات الحيوية و5% horse serum قبل عملية الحقن. ولإجراء الحقن النووي للحمض النووي DNA، يتم تجهيز رأس حقن طويل ورقيق للوصول إلى النواة دون إتلاف البويضات.

بعد ذلك، املأ طرف الحقن بالزيت، ثم ثبته في جهاز الحقن النانوي. تالياً، قم بتركيب جهاز الحقن النانوي تحت مجهر ستيريو واكسر طرف الحقن باستخدام ملقط. بعد ذلك، قم بطرد الزيت حتى لا تبقى أي فقاعات هوائية محبوسة داخل طرف الحقن.

بعد ذلك، ضع 1 µL من pAnap بتركيز 0.1 µg/µL في ماء خالٍ من النوكلياز على قطعة من Parafilm تحت المجهر المجسم، واملأ طرف الحقن بـ DNA. ثم انقل البويضات إلى طبق حقن يحتوي على شبكة ومملوء بمحلول Barth المضاف إليه مضادات حيوية. ونظرًا لأن نواة البويضة تقع في القطب الحيواني، وجه طرف الحقن نحو مركز القطب الحيواني واغرزه بحيث يصل الطرف إلى ما يقرب من مركز نصف الكرة الحيواني.

بعد ذلك، يتم حقن 9.2 nanoliters من محلول pAnap في نواة كل بويضة. ومن ثم، تُحضن البويضات في 2 milliliters من محلول Barth المضاف إليه مضادات حيوية و5% horse serum عند درجة حرارة 18 °C لمدة تتراوح من 6 إلى 24 ساعة للسماح بالتعبير القوي عن tRNAs والـ tRNA synthetases الخاصة بـ Anap. والآن، يتم تجهيز جهاز الحقن النانوي مرة أخرى، ولكن هذه المرة، لا يشترط أن تكون طرف الحقن بنفس دقة الطرف المستخدم في حقن DNA.

اعمل تحت الضوء الأحمر فقط من هذه النقطة لمنع التبييض الضوئي لـ Anap. اخلط 1 µL من Anap بتركيز 1 mM مع 1 µL من mRNA بتركيز 1 إلى 2 µg/µL مباشرة على قطعة من Parafilm، ثم املأ طرف الحقن بمحلول الخليط. اغرز الطرف في القطب النباتي أسفل الغشاء مباشرة، واححقن 46 nL من محلول الخليط في كل بويضة محقونة بـ pAnap.

بعد ذلك، قم بحماية البويضات من الضوء بوضعها في صندوق معتم أو بلف القارورة بورق ألومنيوم. يتم تحضينها في محلول Barth المدعم بالمضادات الحيوية و5% من مصل الخيل عند درجة حرارة 18 degrees Celsius لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. استبدل المحلول بمحلول Barth طازج يومياً، وقم بإزالة البويضات الميتة لتجنب التلوث.

في هذا الإعداد، يتم دمج جهاز تثبيت الجهد (voltage-clamp) المفتوح في إعداد للمجهر الفلوري. يتم تركيب غرفة التسجيل على منزلق يسمح لها بالتحرك بين المجهر المجسم القياسي لوضع البويضة وبين المجهر لإجراء قياسات الفلورة. كما يتم توصيل نظام كشف بالثنائي الضوئي (photodiode) بمنفذ الخروج C-mount للمجهر الفلوري، ويتم توصيل قراءة التيار الضوئي بقناة إدخال ثانية في معالج الإشارات الرقمية.

يُستخدم مصباح هالوجين بقدرة 100 watt وجهد 12 volt كمصدر ضوئي لإثارة الفلورة. ويتم التحكم في عملية الإثارة بواسطة غالق ميكانيكي يقع بين مصدر ضوء الإثارة والمجهر. ويتم تفعيل الغالق عبر نبضة TTL صادرة من معالج الإشارات الرقمية، والموقوتة في برنامج التسجيل بحيث يفتح الغالق قبل حوالي 100 milliseconds من بدء التسجيل، مع ضرورة وجود مكعب مرشح مناسب في برج مكعبات المرشحات.

بالنسبة لتقنية VCF ثنائية اللون، يتم تحضين البويضات المُعدة في TMR maleimide بتركيز 5 µM في محلول الوسم لمدة 15 دقيقة قبل التسجيل مباشرةً. بعد ذلك، تُغسل البويضات بمحلول الوسم ثلاث مرات لإزالة الصبغة الزائدة قبل البدء بالتسجيل. عند هذه النقطة، يكون البروتين قد وُسم تحديداً بفلوروفورين مختلفين.

بعد تثبيت البويضة، بحيث يكون القطب الحيواني متجهًا للأعلى وتكون نفوذة، قم بتمرير الغرفة إلى المجهر والتركيز على البويضة باستخدام عدسة شيئية بقوة 4X. بعد ذلك، قم بثقب البويضة باستخدام قطب V1 لاستشعار الجهد. ثم، انتقل إلى العدسة الشيئية الغمر المائي بقوة 40X.

ركز على القطب الحيواني الموجه للأعلى. بعد ذلك، أطفئ الضوء الأحمر. اختر مكعب مرشح Anap عن طريق تدوير برج مكعب المرشح ومنفذ الخروج البصري المتصل بالصمام الثنائي الضوئي.

بعد ذلك، قم بتشغيل مصباح الهالوجين بأعلى كثافة، وافتح الغالق لمدة تتراوح من ثانيتين إلى خمس ثوانٍ لقراءة كثافة الفلورية الخلفية المنبعثة من البويضة. بعد ذلك، قم بتشغيل الملقط، وحول مفتاح الحمام/الواقي إلى الوضع النشط، واضبط جهد الغشاء على جهد الأمر عن طريق تدوير المقبض الموجود في مرحلة الرأس. لاحقاً، حدد جهد التثبيت، وبروتوكول الخطوة، وعدد النبضات ومدتها في برنامج التسجيل.

بعد ذلك، قم بتسجيل التيارات المعتمدة على الجهد وكثافات فلورية Anap. بالنسبة لـ VCF ثنائي اللون، اختر مكعب مرشح TMR عن طريق تدوير برج المكعبات. اقرأ الفلورية الخلفية لـ TMR، كما هو موضح بالنسبة لـ Anap، وقم بتسجيل التيارات المعتمدة على الجهد وكثافة فلورية TMR في آن واحد.

يُظهر هذا الشكل إشارات الفلورة لـ Anap و TMR باستخدام بروتوكولات تدريجية تم الحصول عليها من نفس البويضة التي تعبر عن طفرة Shaker. ومن خلال إضافة سيستين، يمكن الوصول إليه من المحلول الخارجي، في خلفية L382 stop W434F ووسمه بـ TMR maleimide، يصبح من الممكن سبر الحركات في الوقت الفعلي في مناطق مختلفة من البروتين نفسه في آن واحد. ويتم الحصول على العلاقة بين الجهد والفلورة عن طريق رسم شدة الفلورة في الحالة المستقرة مقابل الجهد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن الأحماض الأمينية غير الطبيعية الفلورية في بويضات Xenopus وكيفية إجراء قياس الفلورية بتثبيت الجهد أحادي اللون أو ثنائي اللون. بمجرد إتقان هذه التقنية، فإنها ستستغرق تقريبًا نفس القدر من الوقت الذي تستغرقه تجارب الفيزيولوجيا الكهربائية التقليدية، مع إضافة خطوة إضافية تتمثل في حقن الـ DNA في نواة البويضة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق من وجود تعبير تسريبي في غياب الحمض الأميني غير الطبيعي.

يجب تنفيذ هذه الخطوة لكل طفرة، حيث تعتمد كمية التعبير التسريبي على موقع إدراج كودون التوقف داخل البروتين. تمكن هذه التقنية الآن الباحثين من دراسة التغيرات التشكلية في الموقع السيتوسولي للبروتين، حيث تحدث العديد من الآليات التنظيمية.