الجهد المشبك فلوروميتري في القيطم البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

توضح هذه المقالة تعزيز التقليدية الجهد المشبك فلوروميتري (فف) حيث يتم استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فوا) بدلا من الأصباغ ماليميد، لتحقيق إعادة ترتيب الهيكلي في القنوات الأيونية. ويشمل الإجراء زينوبوس البويضات حقن الحمض النووي، رنا / فوا سوينجكتيون، والقياسات الحالية والضوضاء في وقت واحد.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال حمض أميني فلوري غير طبيعي في بروتين غشائي معبرا عنه في بويضات Xenopus وتحديد وظيفة البروتين وإعادة الترتيب الهيكلي في وقت واحد ، باستخدام قياس الفلور المشبك الجهدي. ستساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علاقات وظيفة البنية لبروتينات الغشاء. باستخدام قياس الفلور المشبك للجهد ، يمكننا ربط إعادة الترتيب الهيكلي مباشرة بوظيفة البروتين.

تساعد إضافة ملصقات الأحماض الأمينية الفلورية غير الطبيعية إليها في التغلب على القيود السابقة على وضع العلامات. كان هذا في يوم من الأيام إمكانية الوصول إلى مواقع الملصقات بالإضافة إلى وضع العلامات على الخلفية بسبب مواقع الربط الداخلية. يمتد تأثير هذه التقنية إلى فهم أفضل للفيزياء الحيوية لبروتينات الغشاء لأنه يمكنك الآن فحص المجالات ، والتي كان يتعذر الوصول إليها في السابق باستخدام القياس الفلوري التقليدي لمشبك الجهد.

بعد الاستئصال الجراحي لبويضات Xenopus ، اغسل البويضات ثلاث مرات بمحلول SOS. اختر البويضات الكبيرة والصحية بشكل فردي ، واحتضنها عند 18 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل في محلول بارث المكمل بالمضادات الحيوية ومصل الخيل بنسبة 5٪ قبل الحقن. للحقن النووي للحمض النووي ، قم بإعداد طرف حقن طويل ورقيق للوصول إلى النواة دون الإضرار بالبويضات.

ثم املأ طرف الحقن بالزيت ، وقم بتركيب طرف الحقن على جهاز حاقن النانو. بعد ذلك ، قم بتثبيت الحاقن النانوي تحت مجهر ستيريو وكسر نهاية الطرف بالملقط. بعد ذلك ، أخرج الزيت حتى لا تكون هناك فقاعة هواء محاصرة داخل نهاية الحافة.

بعد ذلك ، ضع ميكرولتر واحد من 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر pAnap في ماء خال من النوكلياز على قطعة من Parafilm تحت المجسم ، واملأ طرف الحقن بالحمض النووي. بعد ذلك ، انقل البويضات إلى طبق حقن يحتوي على شبكة يحتوي على محلول بارث المكمل بالمضادات الحيوية. نظرا لأن نواة البويضة تقع في القطب الحيواني ، صوب طرف الحقن في مركز عمود وقم بتثبيته بحيث يصل الطرف بالقرب من مركز نصف الكرة الأرضية.

بعد ذلك ، حقن 9.2 نانولتر من محلول pAnap في نواة كل بويضة. بعد ذلك ، احتضان البويضات في ملليلترين من محلول بارث المكمل بالمضادات الحيوية ومصل الحصان بنسبة 5٪ عند 18 درجة مئوية لمدة ست إلى 24 ساعة للسماح بالتعبير القوي عن الحمض النووي الريبي المرسال الخاص ب Anap وتركيبات الحمض النووي الريبي. الآن ، قم بإعداد الحاقن النانوي مرة أخرى ، ولكن هذه المرة ، لا يلزم أن يكون طرف الحقن رقيقا مثل طرف حقن الحمض النووي.

اعمل في الضوء الأحمر فقط من هذه النقطة لمنع التبييض الضوئي ل Anap. امزج ميكرولتر واحد من Anap سعة ملليمولار مع ميكرولتر واحد من ميكروغرام إلى ميكروغرامين لكل ميكرولتر من الرنا المرسال مباشرة على قطعة من Parafilm ، واملأ طرف الحقن بمحلول المزيج. قم بتثبيت الطرف في القطب النباتي أسفل الغشاء مباشرة ، وحقن 46 نانولترا من محلول المزيج في كل بويضة محقونة ب pAnap.

بعد ذلك ، قم بحماية البويضات من الضوء عن طريق وضعها في صندوق محكم الغلق أو عن طريق لف القارورة بورق الألمنيوم. احتضنها في محلول بارث المكمل بالمضادات الحيوية ومصل الخيول بنسبة 5٪ عند 18 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. استبدله بمحلول بارث الطازج كل يوم ، وقم بإزالة البويضات الميتة لتجنب التلوث.

في هذا الإعداد ، يتم دمج معدات مشبك الجهد المفتوح في إعداد الفحص المجهري الفلوري. يتم تثبيت غرفة التسجيل على شريط تمرير يسمح لها بالتنقل بين المجسم القياسي لوضع البويضة والمجهر لإجراء قياسات التألق. يتم توصيل نظام الكشف عن الثنائي الضوئي بمنفذ الخروج C-mount لمجهر التألق ، ويتم توصيل قراءة التيار الضوئي بقناة إدخال ثانية في معالج الإشارة الرقمية.

يتم استخدام مصباح هالوجين بقوة 100 واط و 12 فولت كمصدر للضوء لإثارة التألق. يتم التحكم في الإثارة بواسطة مصراع ميكانيكي بين مصدر ضوء الإثارة والمجهر. يتم تشغيل التنشيط عبر نبضة TTL القادمة من معالج الإشارات الرقمية التي يتم توقيتها في برنامج التسجيل بحيث يفتح الغالق قبل حوالي 100 مللي ثانية من بداية التسجيل ، ويلزم وجود مكعب مرشح مناسب في برج مكعب المرشح.

بالنسبة ل VCF ثنائي اللون ، قم باحتضان البويضات المحضرة في TMR maleimide بخمسة ميكرومولار في محلول الملصقات لمدة 15 دقيقة مباشرة قبل التسجيل. بعد ذلك ، اغسل البويضات بمحلول الملصقات ثلاث مرات لإزالة الصبغة الزائدة قبل التسجيل. في هذه المرحلة ، يتم تصنيف البروتين على وجه التحديد باثنين من الفلوروفورات المختلفة.

بعد تركيب البويضة ، مع توجيه عمود لأعلى ونفاذه ، حرك الغرفة إلى المجهر وركز على البويضة باستخدام هدف 4X. بعد ذلك ، قم بتقطيع البويضة بقطب V1 مستشعر للجهد. ثم قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء 40X.

ركز على عمود الذي يواجه لأعلى. بعد ذلك ، أطفئ الضوء الأحمر. حدد مكعب مرشح Anap عن طريق تدوير برج مكعب المرشح ومنفذ الخروج البصري المتصل بالصمام الثنائي الضوئي.

بعد ذلك ، قم بتشغيل مصباح الهالوجين بأعلى كثافة ، وافتح الغالق لمدة ثانيتين إلى خمس ثوان لقراءة شدة مضان الخلفية الناشئة عن البويضة. بعد ذلك ، قم بتشغيل المشبك ، واقلب مفتاح الحمام / الواقي إلى نشط ، واضبط إمكانات الغشاء على إمكانات القيادة عن طريق تدوير المقبض على المسرح. بعد ذلك ، حدد إمكانات الاحتفاظ وبروتوكول الخطوة وعدد وطول النبضات في برنامج التسجيل.

بعد ذلك ، قم بتسجيل التيارات المعتمدة على الجهد وشدة مضان Anap. بالنسبة إلى VCF ثنائي اللون، حدد مكعب مرشح TMR عن طريق تدوير برج المكعب. اقرأ مضان الخلفية ل TMR ، كما هو موضح ل Anap ، وسجل التيارات المعتمدة على الجهد وشدة مضان TMR في وقت واحد.

يعرض هذا الشكل إشارات مضان Anap و TMR باستخدام بروتوكولات الخطوة التي تم الحصول عليها من نفس البويضة التي تعبر عن طفرة شاكر. من خلال إضافة السيستين ، الذي يمكن الوصول إليه من المحلول الخارجي ، إلى خلفية L382 stop W434F وتصنيفها باستخدام TMR maleimide ، من الممكن استكشاف الحركات في الوقت الفعلي في مناطق مختلفة من نفس البروتين في وقت واحد. يتم الحصول على علاقة جهد التألق عن طريق رسم شدة مضان الحالة المستقرة مقابل الجهد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن الأحماض الأمينية الفلورية غير الطبيعية في بويضات Xenopus وكيفية إجراء قياس الجهد الفلوري بلون واحد أو لونين. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يجب أن يستغرق الأمر تقريبا نفس القدر من الوقت مثل تجارب الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية ، لديك فقط الخطوة الإضافية المتمثلة في حقن الحمض النووي في نواة البويضة. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من تعبير التسرب في حالة عدم وجود حمض أميني غير طبيعي.

يجب القيام بذلك لكل طفرة ، حيث تعتمد كمية تعبير التسرب على موقع إدخال الكودون التوقف داخل البروتين. تمكن هذه التقنية الباحثين الآن من دراسة التغيرات التوافقية في موقع العصارة الخلوية للبروتين ، حيث تحدث العديد من الآليات التنظيمية.