دقة الخلوية طريقة الاجتثاث لنمذجة إصابة الكلى الحادة في تطوير الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز الاستئصال المستهدف لخلايا الظهارة الكلوية في سمك Zebrafish لنمذجة إصابة النفرون وترميمه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تجديد الأعضاء، وبالتحديد تجديد الكلى؛ مثل: ما هي العمليات الخلوية الرئيسية المشاركة في التجديد، وما هو مدى مرونة الأنسجة الباقية، وغيرها الكثير.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح تحكماً مكانياً وزمانياً دقيقاً في الإصابة، بالإضافة إلى القدرة على ضبط مستوى الإصابة. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى علاج أو تشخيص الإصابة الكلوية الحادة، لأنها تسمح بتقييم مكاني وزماني دقيق للعمليات الخلوية والجزيئية المشاركة في إصابة خلايا الكلى وتجددها. للبدء، قم بإنتاج أجنة عن طريق تهجين أسماك Zebrafish ذات الفلورة GFP في الكلى.

لمدة 24 ساعة بعد الإخصاب، تُحفظ الأجنة في محلول E3 عند درجة حرارة 28.5 degree celsius. بعد ذلك، يُستخدم 0.003%PTU في E3 لاستبدال وسط E3. تُعاد الأجنة إلى الحاضنة لمدة ستة أيام أو أكثر، وهي المرحلة التي تكون فيها الكلى قد نضجت.

لتثبيت سمكة الزيبرا (Zebrafish) من أجل التصوير الحي، قم بتحضير أغاروز منخفض الانصهار بتركيز 1% إلى 2% مع محلول تريغين (trigaine) بتركيز 0.2 milligrams per milliliter. تأكد من أن محلول الأغاروز والتريغين قد برد قبل استخدام ماصة بلاستيكية أو زجاجية لنقل الجنين إلى المحلول. بعد ذلك، باستخدام ماصة نقل، اسحب اليرقة الموجودة في الأغاروز وضعها في منتصف طبق قطر 35 millimeter.

قم بتوزيع الأجاروز الذي يحتوي على سمكة الزيبرا بسرعة لتغطية قاع الطبق بشكل متساوٍ. ثم استخدم مسباراً زجاجياً لتوجيه اليرقة من أجل الاستئصال الضوئي والتصوير، بحيث يكون الجزء المستهدف من الكلية عمودياً على مسار الشعاع، بينما يكون الجزء المقابل بعيداً عن شعاع الليزر. يُعد توجيه سمكة الزيبرا أمراً بالغ الأهمية للخطوات التالية التي تتضمن الاستئصال بالليزر.

يُنصح باتباع تقنية جيدة لضمان بقاء اليرقات في وضع عمودي داخل الأجاروز. قم بتغطية طبق بتري لتقليل التبخر واترك الأجاروز يتصلب لمدة 15 دقيقة تقريباً. بعد إعداد المجهر البؤري (confocal microscope)، وفقاً للبروتوكول المكتوب، في التكوين الرأسي، ضع طبق بتري الذي يحتوي على اليرقة فوق شريحة مجهرية واستخدم صلصال النمذجة لتثبيته في مكانه.

بعد ذلك، ضع طبق بتري المنزلق على منصة المجهر. ثم، أضف ثلاثة milliliters من محلول التصوير. وباستخدام عدسة غمر مائية، ارفع المنصة ببطء، مع التأكد من إمالة العدسة قليلاً لمنع حبس الهواء في مسار الشعاع.

بمجرد ملامسة العدسة للمحلول بزاوية معينة، قم بتوسيطها بحيث تكون في مجال الرؤية عند الجنين. الآن، وباستخدام مصدر الضوء الفلوري، حدد الجزء المطلوب دراسته، ثم ركز على الفرع السطحي لاستهدافه بالإصابة. يتم اختيار الفروع السطحية لتقليل تشتت الضوء.

في برنامج المجهر، انتقل إلى العرض (view)، ثم التحكم في الاستحواذ (acquisition control)، ثم واجهة المستخدم الرسومية المدمجة C2plus compact GUI. اضبط زمن بقاء البكسل على 1.9 microseconds، وحجم الإطار على 512 by 512 pixels، وحجم الثقب (pinhole) على 90 microns. اضبط شدة ليزر 405 nanometer على صفر، وشدة ليزر 488 على قيمة منخفضة.

أثناء استخدام ليزر 488 نانومتر، انقر فوق "مسح" (scan) في واجهة البرنامج. حدد الجزء المطلوب أن يكون عموديًا على مسار الشعاع ويظهر بوضوح مع فلورة GFP جيدة. وبمجرد تحديد تلك المنطقة، انتقل إلى ROI، ثم اختر "رسم منطقة اهتمام بيضاوية" (draw elliptic ROI)، لرسم منطقة الاهتمام.

بعد ذلك، انتقل إلى عرض (view)، ثم ضوابط الاستحواذ (acquisition controls)، ثم منطقة مسح C2plus (C2plus scan area) واختر منطقة مسح النطاق (band scan area)، حيث سيظهر القناع المستطيل ضمن هذه الواجهة. باستخدام المؤشر، حدد يدويًا مسحًا مستطيلًا ليغطي الجزء المستهدف للاستئصال بالليزر. انقر بزر الماوس الأيمن داخل منطقة القناع لقبول التحديد.

باستخدام ليزر 488 nanometer فقط لتنشيط GFP، ابدأ قياس الوقت أثناء مراقبة القناة الخضراء. تأكد من أن شدة ليزر 488 منخفضة نسبيًا. قم بقياس متوسط شدة GFP في المنطقة المستهدفة عن طريق اختيار قياس، قياس الوقت.

استخدم علامة تبويب الرسم البياني أو البيانات لمراقبة متوسط مستويات الشدة داخل منطقة الاهتمام (ROI). وباستخدام الليزر البنفسجي، قم بإحداث تلف في خلايا الكلى عن طريق زيادة الشدة إلى 100% من خلال سحب شريط التحكم في طاقة الليزر إلى أقصى اليمين. وفي علامة تبويب الرسم البياني، راقب الرسم البياني الخطي أو استخدم علامة تبويب البيانات لملاحظة القيم العددية لشدة GFP وانتظر حتى تنخفض إلى المستوى المطلوب.

على سبيل المثال، 50% من الخط القاعدي. وبمجرد انخفاض شدة GFP داخل منطقة الاهتمام (ROI) البيضاوية إلى المستوى المطلوب، قم فوراً بخفض شدة الليزر البنفسجي إلى الصفر في لوحة تحكم البرنامج عن طريق تحريك منزلق قدرة الليزر تماماً إلى اليسار. وأخيراً، قم بالحصول على خط قاعدي جديد لفلورة GFP.

كما هو موضح في هذا الشكل، بعد التعرض لضوء ليزر بطول موجي 405 nanometer، يستمر تلاشي فلورة GFP خلية تلو الأخرى. وحتى الدقيقة 220، يفقد الجزء المستأصل بأكمله 100% من إيجابية GFP. ويعود ذلك إلى موت الخلايا وليس إلى تثبيط تعبير GFP، وهو ما يتضح من ظهور نوى إيجابية لصبغة propidium iodide ذات الفلورة الحمراء في الخلايا التي تفقد إيجابية GFP.

توضح هذه الصور أنه من خلال تغيير التعرض الأولي، يمكن ضبط درجة الإصابة والاستجابة في الظهارة المصابة. فمع تبييض ضوئي أولي لبروتين GFP بنسبة 10% إلى 20%، لا يُلاحظ فعلياً أي انخفاض في إيجابية GFP بعد خمس ساعات من الإصابة. وتؤدي نسبة 50% و60% إلى اختفاء كامل لبروتين GFP بعد خمس ساعات، بينما يؤدي التبييض بنسبة 30% و40% إلى نتائج متوسطة، حيث لُوحظ موت تقديري بنسبة 50% عند تبييض ضوئي بنسبة 35% تقريباً.

يدعم ذلك صبغ يوديد البروبيديوم، حيث يؤدي التبييض الضوئي بنسبة 20% إلى انعدام صبغ يوديد البروبيديوم تقريبًا بعد 100 دقيقة من الاستئصال. ومع ذلك، يؤدي التبييض الضوئي بنسبة 50% إلى إيجابية مستمرة لصبغ يوديد البروبيديوم في الظهارة المستأصلة بعد 60 دقيقة. بينما يؤدي التبييض الضوئي بنسبة 30% و 40% إلى دمج متوسط ليوديد البروبيديوم.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 30 دقيقة إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. ولا تنسَ أن العمل مع الليزر والكواشف الكيميائية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل تجنب النظر إلى شعاع الليزر واستخدام القفازات عند التعامل مع المواد الكيميائية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر الفاصل الزمني (time lapse microscopy)، والتلوين المناعي الفلوري، وغيرها من الطرق للإجابة على أسئلة إضافية تهدف إلى تحليل إصابة الكلى وترميمها على المستويين الخلوي والجزيئي.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد الكلى بعد تطويرها. وذلك لاستكشاف دور الهجرة الخلوية الجماعية وإصلاح الكلى بعد الإصابة في سمك Zebrafish. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) لإصابة أجزاء محددة من الكلى في يرقات وأجنة سمك Zebrafish المعدلة وراثياً بـ GPF.