مستوحاة تشريحيا ثلاثي الأبعاد الأنسجة الدقيقة المهندسة الشبكات العصبية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي، والتحوير، والنمذجة

يصف هذا البروتوكول تصنيع الشبكات العصبية المهندسة للأنسجة الدقيقة أو micro-TENNs ، وهي عبارة عن تركيبات مصغرة ثلاثية الأبعاد تتكون من مسالك محورية طويلة محاذاة تمتد على مجموعات عصبية منفصلة داخل تجويف هيدروجيل أنبوبي. تكرر Micro-TENNs تشريح مستوى النظام العام للشبكة العصبية الدماغية ، على وجه التحديد ، مجموعات متشابهة وظيفيا من الخلايا العصبية المتصلة بمسالك محورية طويلة. نظرا لأنها نمت مسبقا لمحاكاة البنية الخلوية لمسارات الدماغ ، يمكن تطبيق micro-TENNs لإعادة البناء المستهدف للدوائر العصبية المفقودة بسبب الصدمة أو الأمراض التنكسية العصبية وكنماذج حيوية للدراسات العصبية الحيوية.

أحد أكثر الجوانب تحديا في هذا البروتوكول هو العمل مع عامل شكل مقياس ميكرون ، وهو أمر ضروري في النهاية للسماح بالتوصيل طفيف التوغل إلى الدماغ. ابدأ بتكسير الأنابيب الشعرية الزجاجية يدويا إلى شظايا من 2 إلى 2.5 سم ، وأدخل إبرة واحدة للوخز بالإبر في كل جزء. انقل ملليلتر واحد من ثلاثة بالمائة من الاغاروز في DPBS إلى سطح طبق بتري فارغ.

أمسك الأنبوب الشعري في الإبرة المدخلة ، ضع أحد طرفي الأنبوب على اتصال بحوض الاغاروز السائل لملئه عن طريق العمل الشعري. عندما يتوقف السائل عن الارتفاع ، قم بإزالة الأنبوب الشعري من المسبح ، وضعه أفقيا على سطح طبق بتري. بعد ذلك ، ضع إصبع الإبهام والسبابة على جانبي الأنبوب وامسكه بإحكام.

استخدم اليد الأخرى لسحب الإبرة بسرعة للخارج بينما يمنع الإبهام والسبابة العمود الصغير نفسه من الانزلاق خارج الأنبوب. ثم أدخل إبرة قياس 30 في الأنبوب الشعري لدفع العمود الصغير ببطء إلى الخارج في طبق يحتوي على DPBS. انقل عمودا صغيرا واحدا بعناية من DPBS إلى طبق فارغ باستخدام ملقط ناعم.

أضف 10 ميكرولترات من DPBS إلى الجزء العلوي من العمود الصغير باستخدام معبر دقيقة لمنع الجفاف. أثناء العمل تحت مجهر مجسم ، قم برحلة العمود الصغير بمشرط صغير لتقصيره إلى الطول المطلوب. ثم استخدم ملقطا دقيقا لنقل العمود الصغير المشذب إلى طبق بتري مختلف يحتوي على DBPS.

عقم الأعمدة الدقيقة في أطباق بتري المحتوية على DPBS تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. استخدم مثقاب لثقب 16 حفرة كمصفوفة 4 × 4 سم مع فصل 1 سم في غطاء طبق بتري بطول 10 سم. داخل غطاء الدخان الكيميائي ، استخدم القطعة السفلية من طبق بتري لتزن 27 جراما من PDMS وثلاثة جرامات من عامل المعالجة.

يقلب بملعقة صغيرة لتوزيع العامل بالتساوي. ثم قم بتغطية عامل معالجة PDMS بالغطاء المثقوب. قم بتوصيل أحد طرفي الخرطوم بمنفذ التفريغ لغطاء الدخان ، وأدخل الطرف الآخر في جذع قمع بحجم مناسب.

ضع لمبة ماصة سعة 1 مليلتر على طرف سعة 1 مليلتر في الخرطوم، واسحب الخرطوم لأعلى حتى يغلق المصباح الخرطوم في جذع القمع. بعد ذلك ، ضع القمع على غطاء الطبق المثقوب وقم بتأمين الخرطوم بدعم قوي متاح. افتح صمام التفريغ لمدة خمس دقائق للشفط وإحضار فقاعات الهواء إلى السطح.

بعد خمس دقائق ، أغلق الصمام ، وقم بإزالة القمع ، واضرب طبق بتري على سطح غطاء الدخان عدة مرات لتفجير أي فقاعات هواء متبقية. ضع قالبا هرميا مطبوعا ثلاثي الأبعاد في كل بئر في صفيحة ثقافة مكونة من 12 بئرا مع توجيه الأهرامات لأعلى. ثم اسكب عامل المعالجة PDMS فوق القوالب حتى تمتلئ كل بئر من اللوحة.

انقلي الطبق المغطى إلى فرن لمدة ساعة على حرارة 60 درجة مئوية حتى يجف. بعد تعقيم مصفوفات PDMS عن طريق التعقيم ، والعمل في خزانة السلامة الحيوية ، أدخل مجموعة بئر صغيرة واحدة في كل بئر من لوحة معقمة مكونة من 12 بئرا. لتشكيل المجاميع العصبية ، استخدم ماصة دقيقة لإضافة 12 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل بئر صغير من مجموعة PDMS.

الطرد المركزي للوحة عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق لإجبار الخلايا على تجميع الخلايا في قاع الآبار الصغيرة. ثم أضف بعناية ما يقرب من ملليلترين من وسط الاستزراع إلى الجزء العلوي من كل مصفوفة PDMS لتغطية جميع الآبار الصغيرة المصنفة. احتضان اللوحة لمدة 12 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لبدء تصنيع نواة CEM ، قم بخلط النوع 1 من الكولاجين واللامينين ووسط الثقافة في أنبوب طرد مركزي صغير واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 إلى 7.4. ثم ضع الأنبوب الذي يحتوي على CEM على الجليد. استخدم ملقطا معقما لنقل الأعمدة الدقيقة لتفريغ أطباق بتري 35 أو 60 ملم.

بعد ذلك ، أثناء العمل تحت مجهر مجسم ، استخدم طرفا سعة 10 ميكرولتر متصلا بطرف سعة 1000 ميكرولتر لاستخراج DPBS المتبقية وفقاعات الهواء من التجويف. ارسم بسرعة أربعة إلى خمسة ميكرولترات من CEM في ماصة دقيقة ، ثم ضع طرف الماصة الدقيقة في أحد طرفي العمود الصغير ، وقم بتفريغ ما يكفي من CEM لملء التجويف. لمنع الجفاف ، أضف ميكرولترين من CEM حول كل عمود صغير.

احتضان الأعمدة الدقيقة للهيدروجيل CEM في أطباق بتري عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. انتقل إلى بذر الخلايا مباشرة بعد الحضانة. انقل ما يقرب من 10 إلى 20 ميكرولترا من وسط الاستزراع إلى منطقتين خالتين في أطباق بتري التي تحمل الأعمدة الدقيقة.

استخدم ماصة دقيقة لجمع المجاميع العصبية بشكل فردي ، ونقلها إلى طبق بتري الذي يحتوي على البنيات. انقل الركام بالملقط إلى أحد التجمعات الصغيرة لوسط الاستزراع للحفاظ على صحة الخلية. أثناء المراقبة تحت المجهر المجسم ، استخدم الملقط لإدخال ركام في أحد طرفي الأعمدة الدقيقة ل micro-TENNs أحادية الاتجاه ، أو في كل طرف للبنية ثنائية الاتجاه.

ثم انقل العمود الصغير المصنف إلى مجموعة صغيرة أخرى من وسط الاستزراع لتجنب الجفاف والحفاظ على الصحة الإجمالية. عندما يتم تحميل جميع الأعمدة الدقيقة ، احتضن عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة للسماح للركام بالالتصاق ب CEM. بعد الحضانة ، تحقق من بقاء الركام في نهايات الأعمدة الدقيقة باستخدام المجهر المجسم.

أخيرا ، قم بإغراق أطباق بتري التي تحتوي على micro-TENNs بعناية بوسط الاستزراع باستخدام ماصة. ضع الأطباق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون للاستزراع على المدى الطويل. تظهر صور تباين الطور هذه micro-TENNs أحادية الاتجاه بطول 2 مليلتر تصل إلى ثمانية أيام في المختبر.

في هذه الصور ، لاحظ التكاميع العصبية في أقصى العمود الصغير بينما تظهر المسالك المحورية المحاذاة عبر التجويف. كما هو موضح هنا ، تمتد المسالك المحورية بطول العمود الصغير بالكامل تقريبا لمدة خمسة أيام في المختبر. بالنسبة إلى TENNs الدقيقة ثنائية الاتجاه 5 ملم ، تملأ المسالك المحورية طول العمود الصغير في 5 أيام في المختبر ، ويتم الحفاظ على هذه البنية على الأقل حتى 10 أيام في المختبر.

يمكن أن تساعد الصورتان التاليتان في استكشاف مشكلات الإجراء وإصلاحها. تظهر هذه الصورة عمودا صغيرا من الهيدروجيل المجفف تماما نتيجة للإزالة الكاملة و / أو التبخر ل DPBS أو CEM أو وسط الثقافة أثناء التصنيع. تظهر هذه الصورة عمودا صغيرا مع التجويف الذي يبطن الجدار الخارجي بسبب عدم وجود محاذاة متحدة المركز لإبرة الوخز بالإبر مع الأنبوب الشعري.

أخيرا ، تظهر هذه الصورة متحدة البؤر micro-TENN ثنائي الاتجاه في 28 يوما في المختبر ، ملطخة بنوية الخلايا مع Hoechst باللون الأزرق ، ومحاور مسمى باللون الأحمر ، والعروات قبل التشابك المسمى ب synapsin 1 باللون الأخضر. تظهر هجرة الخلايا من الركام على طول المسالك المحورية في وجود أطراف ما قبل التشابك كما هو مقترح. Micro-TENNs عبارة عن تركيبات قائمة بذاتها ومستوحاة من التشريح تحاكي الجوانب الرئيسية للهندسة الخلوية الشبكية. لذلك ، قد توفر micro-TENNs وسيلة لاستبدال المسارات العصبية المفقودة عند الزرع في الدماغ.

تشمل المكونات الحاسمة لهذه الطريقة مخطط تغليف المواد الحيوية الأنبوبي ، والذي يسمح بالنمو المحوري الطولي ، والطريقة الكلية ، والتي تضمن الحصول على البنية الخلوية المناسبة لأجسام الخلايا المقيدة بنهايات المسالك المحورية على طول الداخل. بعد إتقان هذه الطرق ، يمكن تطبيق مبادئ هذه التقنية لبناء TENNs الدقيقة مع الأنماط الظاهرية الخلوية الأخرى ومكونات المواد الحيوية ، وفقا للتطبيق المحدد.