مستوحاة تشريحيا ثلاثي الأبعاد الأنسجة الدقيقة المهندسة الشبكات العصبية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي، والتحوير، والنمذجة

يصف هذا البروتوكول عملية تصنيع الشبكات العصبية المهندسة من الأنسجة الدقيقة أو ما يعرف بـ micro-TENNs، وهي عبارة عن تراكيب ثلاثية الأبعاد مصغرة تتكون من حزم محورية طويلة ومصطفة تربط بين مجموعات عصبية منفصلة داخل تجويف هيدروجيل أنبوبي. تحاكي micro-TENNs التشريح العام لمستوى أنظمة الموصلات الدماغية (connectome)، وتحديداً مجموعات الخلايا العصبية المتشابهة وظيفياً والمرتبطة عبر حزم محورية طويلة. ونظراً لكونها مُستنبتة مسبقاً لمحاكاة البنية الخلوية للمسارات الدماغية، يمكن تطبيق micro-TENNs في إعادة البناء المستهدف للدوائر العصبية المفقودة بسبب الصدمات أو الأمراض التنكسية العصبية، وكذلك كنماذج ذات دقة حيوية عالية للدراسات النيوروبيولوجية.

أحد أكثر الجوانب تحديًا في هذا البروتوكول هو العمل مع حجم قياسي بمقياس الميكرون، وهو أمر ضروري في نهاية المطاف للسماح بعملية توصيل ذات تدخل جراحي أدنى إلى الدماغ. ابدأ بتكسير أنابيب الشعيرات الزجاجية يدويًا إلى قطع يتراوح طولها من 2 إلى 2.5 سنتيمتر، وأدخل إبرة وخز واحدة في كل قطعة. انقُل 1 mL من أغاروز بتركيز 3% في DPBS إلى سطح طبق بتري فارغ.

أثناء إمساك الأنبوب الشعري في الإبرة المُدخلة، ضع أحد طرفي الأنبوب في ملامسة مع تجمع أغاروز السائل لملئه عن طريق الخاصية الشعرية. وعندما يتوقف السائل عن الارتفاع، أخرج الأنبوب الشعري من التجمع، وضعه أفقيًا على سطح طبق بتري. بعد ذلك، ضع الإبهام والسبابة على كلا جانبي الأنبوب وأمسكهما بإحكام.

استخدم اليد الأخرى لسحب الإبرة بسرعة بينما يمنع الإبهام والسبابة العمود الدقيق نفسه من الانزلاق خارج الأنبوب. ثم أدخل إبرة قياس 30 في الأنبوب الشعري لدفع العمود الدقيق ببطء إلى طبق يحتوي على DPBS. انقل عموداً دقيقاً واحداً بعناية من DPBS إلى طبق فارغ باستخدام ملقط دقيق.

أضف 10 µL من DPBS إلى الجزء العلوي من العمود الدقيق باستخدام ماصة دقيقة لمنع الجفاف. وأثناء العمل تحت مجهر ستيريو، قم بقص العمود الدقيق باستخدام مشرط دقيق لتقصيره إلى الطول المطلوب. ثم استخدم ملقطاً دقيقاً لنقل العمود الدقيق المقصوص إلى طبق بتري آخر يحتوي على DBPS.

قم بتعقيم الأعمدة الدقيقة الموجودة في أطباق بتري التي تحتوي على DPBS تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. استخدم ريشة مثقاب لثقب 16 ثقباً على شكل مصفوفة 4 في 4 بمساحة 4 سنتيمتر وبفاصل 1 سنتيمتر في غطاء طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر. داخل خزانة استخلاص الأبخرة الكيميائية، استخدم القطعة السفلية من طبق بتري لوزن 27 جراماً من PDMS وثلاثة جرامات من عامل المعالجة.

حرك المزيج باستخدام ملعقة دقيقة (micro spatula) لتوزيع العامل بالتساوي. ثم قم بتغطية عامل معالجة PDMS بالغطاء المثقوب. صِل أحد طرفي الخرطوم بمنفذ التفريغ في خزانة استخراج الأدخنة، وأدخل الطرف الآخر في ساق قمع ذي حجم مناسب.

ضع بصيلة ماصة سعة 1 ملليلتر على طرف ماصة سعة 1 ملليلتر داخل الخرطوم، ثم اسحب الخرطوم للأعلى حتى تُغلق البصيلة الخرطوم عند ساق القمع. بعد ذلك، ضع القمع على غطاء الطبق المثقوب وثبّت الخرطوم بدعامة قوية متوفرة. افتح صمام التخلخل لمدة خمس دقائق لسحب الهواء وجلب الفقاعات الهوائية إلى السطح.

بعد مرور خمس دقائق، أغلق الصمام، وأزل القمع، ثم اطرق طبق بتري مقابل سطح خزانة طرد الغازات عدة مرات لتفجير أي فقاعات هواء متبقية. ضع قالباً مطبوعاً ثلاثياً الأبعاد ذو بئر هرمي في كل بئر من آبار لوحة زراعة مكونة من 12 بئراً بحيث تكون الهرمات متجهة للأعلى. ثم صب عامل معالجة PDMS فوق القوالب حتى يتم ملء كل بئر في اللوحة.

انقل الطبق المغطى إلى فرن لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية للتجفيف. بعد تعقيم مصفوفات PDMS بواسطة الموصدة (autoclaving)، وباستخدام كابينة السلامة البيولوجية، أدخل مصفوفة آبار دقيقة واحدة في كل بئر من طبق معقم يحتوي على 12 بئراً. ولتكوين التجمعات العصبية، استخدم ماصة دقيقة لإضافة 12 µL من معلق الخلايا في كل بئر دقيق من مصفوفة PDMS.

قم بطرد الطبق مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق لإجبار الخلايا على التكتل في قاع الآبار الدقيقة. بعد ذلك، أضف بعناية حوالي 2 mL من وسط الزرع إلى أعلى كل مصفوفة PDMS لتغطية جميع الآبار الدقيقة المزروعة. قم بحضن الطبق لمدة تتراوح من 12 إلى 24 ساعة عند 37 °C في 5% ثاني أكسيد الكربون.

لبدء عملية تصنيع لب CEM، اخلط كولاجين من النوع 1، واللامينين، ووسط استزراع في أنبوب طرد مركزي دقيق واضبط قيمة الـ pH لتكون بين 7.2 و7.4. بعد ذلك، ضع الأنبوب الذي يحتوي على CEM على الثلج. استخدم ملاقط معقمة لنقل الأعمدة الدقيقة إلى أطباق بتري فارغة بقطر 35 أو 60 مليمتر.

بعد ذلك، وأثناء العمل تحت مجهر ستيريو، استخدم طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر متصلاً بطرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر لاستخراج بقايا DPBS وفقاعات الهواء من التجويف. اسحب بسرعة من أربعة إلى خمسة ميكرولتر من CEM باستخدام الماصة الدقيقة، ثم ضع طرف الماصة الدقيقة عند أحد طرفي العمود الدقيق، وفرغ كمية كافية من CEM لملء التجويف. ولمنع الجفاف، أضف ميكرولترين من CEM حول كل عمود دقيق.

يتم تحضين الأعمدة الدقيقة CEM من الهيدروجيل في أطباق بتري عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. يتم البدء في استزراع الخلايا فوراً بعد التحضين. ينقل ما يقرب من 10 إلى 20 µL من وسط الزرع إلى منطقتين خاليتين في أطباق بتري التي تحتوي على الأعمدة الدقيقة.

استخدم ماصة دقيقة لجمع التجمعات العصبية بشكل فردي، وانقلها إلى طبق بتري الذي يحتوي على البنيات. انقل التجمعات باستخدام ملقط إلى إحدى البرك الصغيرة من الوسط الزراعي للحفاظ على صحة الخلايا. وأثناء الملاحظة تحت مجهر ستيريو، استخدم الملقط لإدخال تجمع عصبي عند أحد طرفي الأعمدة الدقيقة لإنشاء شبكات عصبية دقيقة (micro-TENNs) أحادية الاتجاه، أو عند كل طرف من أجل بنية ثنائية الاتجاه.

بعد ذلك، انقل العمود الدقيق المزروع إلى الحوض الصغير الآخر الذي يحتوي على الوسط الزراعي لتجنب الجفاف وللحفاظ على سلامة التجمعات الخلوية. وعندما يتم تحميل جميع الأعمدة الدقيقة، قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية في 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة للسماح للتجمعات الخلوية بالالتصاق بـ CEM. وبعد التحضين، تحقق من بقاء التجمعات الخلوية عند نهايات الأعمدة الدقيقة باستخدام المجهر التشريحي.

أخيراً، قم بغمر أطباق بتري التي تحتوي على الـ micro-TENNs بعناية باستخدام وسط استنبات بواسطة ماصة. ضع الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5% carbon dioxide للزراعة طويلة الأمد. تُظهر صور تباين الطور هذه micro-TENNs أحادية الاتجاه بطول 2-milliliter حتى ثمانية أيام في المختبر (in-vitro).

في هذه الصور، لاحظ التجمعات العصبونية عند طرفي العمود الدقيق بينما تمتد الحزم المحورية المصطفة عبر التجويف. وكما يظهر هنا، تمتد الحزم المحورية على طول العمود الدقيق تقريباً بحلول اليوم الخامس من الزرع المختبري. وبالنسبة للشبكات العصبونية النانوية الدقيقة (micro-TENNs) ثنائية الاتجاه بطول 5 مليمتر، تشغل الحزم المحورية طول العمود الدقيق في اليوم الخامس من الزرع المختبري، ويتم الحفاظ على هذا البنيان حتى اليوم العاشر من الزرع المختبري على الأقل.

يمكن للصورتين التاليتين المساعدة في استكشاف المشكلات المتعلقة بالإجراء وإصلاحها. تُظهر هذه الصورة عموداً ميكروياً من الهيدروجيل المجفف وهو في حالة جفاف تام نتيجة للإزالة الكاملة و/أو تبخر DPBS أو CEM أو وسط الزرع أثناء عملية التصنيع. وتُظهر هذه الصورة عموداً ميكروياً حيث يبطن اللمعة الجدار الخارجي بسبب عدم المحاذاة المركزية لإبرة الوخع مع الأنبوب الشعري.

أخيرًا، تُظهر هذه الصورة المجهرية البؤرية (confocal image) شبكة عصبية مصغرة (micro-TENN) ثنائية الاتجاه بعد 28 يومًا من الزراعة المختبرية (in-vitro)، حيث صُبغت نوى الخلايا بصبغة Hoechst باللون الأزرق، وعُلّمت المحاور العصبية ببروتين tudge one باللون الأحمر، وعُلّمت البراعم قبل التشابكية ببروتين synapsin 1 باللون الأخضر. ويُلاحظ هجرة الخلايا من التجمعات على طول المسارات المحورية في وجود النهايات قبل التشابكية كما هو مقترح. تُعد الشبكات العصبية المصغرة (micro-TENNs) بنيات ذاتية الاحتواء ومستوحاة تشريحيًا تحاكي الجوانب الرئيسية للبنية الخلوية للموصّلات العصبية (connectome cytoarchitecture)؛ لذا، قد توفر هذه الشبكات وسيلة لاستبدال المسارات العصبية المفقودة عند زرعها في الدماغ.

تشمل المكونات الحاسمة لهذه الطريقة مخطط التغليف بمادة حيوية أنبوبية، والذي يسمح بالنمو المحوري الطولي، وطريقة التجميع، التي تضمن الحصول على البنية الخلوية المناسبة لأجسام الخلايا المقتصرة على نهايات المسارات المحورية على طول الجزء الداخلي. بعد إتقان هذه الطرق، يمكن تطبيق مبادئ هذه التقنية لبناء شبكات عصبية في TENNs مصغرة باستخدام أنماط خلوية ومكونات مواد حيوية أخرى، وفقاً للتطبيق المحدد.