عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الخميرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأنابيب الدقيقة ، مثل كيفية تنظيم الطفرات في الأنابيب ومنظمات الأنابيب الدقيقة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلية الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن خلايا الخميرة الحية مستقرة في الصورة.

بدلا من ذلك ، دقة زمنية عالية لمدة عشر دقائق ، أو دقة زمنية منخفضة لعدة ساعات. سيتم توضيح الإجراء كولبي فيس ، وكاسي إستريم ، وهما طالبان دراسات عليا من مختبري. تم بناء خلايا الخميرة المستخدمة في هذه التجربة للتعبير بشكل أساسي عن التوبولين المسمى GFP.

تلقيح حوالي ميكرولتر واحد من خلايا الخميرة من مستعمرة واحدة على طبق في ثلاثة ملليلتر من الوسط الاصطناعي الكامل. اسمح للخلايا بالنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة المشبعة إلى OD600 أقل من 0.1 في الوسط.

أعد المزرعة المخففة إلى شاكر 30 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات ، أو حتى يتراوح OD600 بين 0.4 و 0.8. ابدأ في تحضير شرائح غرفة التدفق عن طريق قطع ورقة من فيلم البارافين إلى قطعة بعرض أربع بوصات وطول سبع بوصات. ضع شريحة مجهر قياسية بالطول على عرض أربع بوصات من فيلم البارافين ولف الفيلم حول الشريحة ثلاث إلى أربع مرات بحيث تكون الشريحة مغطاة بفيلم بسمك ثلاث إلى أربع طبقات.

اضغط على الطبقات معا للتأكد من وجود ختم معقول ، ولكن تجنب الضغط بشدة أو التسبب في تجعد الفيلم. باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة لقطع الصندوق ، وشريحة أخرى لتوفير حافة مستقيمة للقطع ، قم بقص فيلم البارافين على طول الحواف الخارجية للشريحة. انزع الفيلم الزائد من شريحة العمل وتخلص منه.

باستخدام الشريحة الثانية كحافة مستقيمة ، قم بقص طبقات الفيلم المكدسة على طول المحور الطويل للشريحة إلى حوالي 10 شرائط ، عرض كل منها من ملليمترين إلى أربعة ملليمترات. بعد ذلك ، قم بقص طبقات فيلم البارافين المكدسة بشكل عمودي على القطع السابقة على طول المحور القصير للشريحة لإنشاء شرائط بعرض من ملليمترين إلى أربعة ملليمترات ، وطولها من 23 إلى 24 ملم ، وسمك ثلاث إلى أربع طبقات. استخدم ماكينة حلاقة بزاوية 45 درجة لتقشير شرائط الفيلم المقطوعة.

ثم استخدم الملقط لتوزيع الشرائط المقطوعة بالتساوي على شريحة مجهر نظيفة لإنشاء العدد المطلوب من الغرف. في هذا المثال ، سيتم استخدام أربعة شرائط فيلم لإنشاء ثلاث غرف. ضع زلة غطاء واحدة أعلى شرائط الفيلم ، وحركها إلى موضعها باستخدام الملقط.

ضع الشريحة المحضرة ، وقم بتغطيتها ، على لوح ساخن على درجة حرارة 95 درجة مئوية تقريبا ، وقم بتسخين الشريحة لمدة ثلاث دقائق تقريبا حتى تصبح شرائط الفيلم شفافة. أغلق الشريحة وانزلاق الغطاء معا باستخدام ملاقط للضغط برفق على مناطق زلة الغطاء الموجودة مباشرة فوق شرائط فيلم البارافين. استخدم ملقطا لإزالة الشريحة من اللوح الساخن ، واتركها جانبا لتبرد بحيث يكون جانب انزلاق الغطاء متجها لأعلى.

عندما تبرد الشريحة ، سيعود الفيلم إلى اللون الأبيض المعتم. لبدء هذا الإجراء ، قم بإذابة 200 ميكرولتر مجمدة من Concanavalin A في درجة حرارة الغرفة. أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من Concanavalin A المذاب إلى كل حجرة من الشريحة المحضرة عن طريق سحب العينة في أحد الأطراف المفتوحة.

ثم قم بتعليق الشريحة ، وانزلق الغطاء لأسفل ، بين رفوف أنبوب ميكروفوجي لمدة خمس دقائق للسماح ل Concanavalin A بالالتصاق بزلة الغطاء. أعد الشريحة إلى وضع انزلاق الغطاء ، وقم بإزالة Concanavalin A عن طريق غسل الغرفة بوسط اصطناعي كامل. قم بتدفق ضعف حجم الغرفة من الوسط عبر الغرفة باستخدام زاوية منشفة ورقية لسحب السوائل من أحد طرفي الغرفة ، مع سحب السوائل الطازجة في نفس الوقت إلى الطرف الآخر من الغرفة.

قم بتحميل الخلايا عن طريق تدفق ضعف حجم الغرفة لتعليق الخلية باستخدام طريقة التدفق الموجه. قم بتعليق الشريحة ، وانزلق الغطاء لأسفل ، لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالالتصاق بزلة الغطاء. اغسل أي خلايا غير ملتصقة عن طريق التدفق عبر أربعة أضعاف حجم الغرفة للوسط الاصطناعي الكامل.

جفف كل طرف من طرفي الغرفة بعناية بزاوية نظيفة من منشفة ورقية ، مما يجعل الغضروف المفصلي يصل إلى حافة زلة الغطاء. أغلق كل طرف من طرفي الغرفة بمادة مانعة للتسرب دافئة. سيتم الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب مجهز بهدف 1.45 NA 100X CFI Plan Apo ، ومرحلة كهرضغطية ، ووحدة مسح متحد البؤر للقرص الدوار ، وليزر إضاءة ، وكاميرا EMCCD.

حافظ على درجة حرارة المرحلة في درجة حرارة الغرفة أثناء الحصول على الصورة. اجلب التركيز على الخلايا وابحث في الشريحة عن الخلايا المجمعة معا للتأكد من أن حقل الاستحواذ يحتوي على ما لا يقل عن خمس إلى ست خلايا مجمعة معا على نفس المستوى البؤري. برمجة عملية استحواذ متعددة الأبعاد لجمع zSeries متعددة بمرور الوقت.

اضبط الإعدادات ضمن إعدادات الاستحواذ النشطة على ما يلي: إجمالي عمق Z البالغ ستة ميكرومتر ليشمل خلية الخميرة بأكملها ، وحجم خطوة Z 300 نانومتر لزيادة جمع الضوء إلى أقصى حد دون الإفراط في أخذ العينات ، والمدة الزمنية الإجمالية 10 دقائق ، والفترات الزمنية الزمنية لمدة أربع ثوان بين zSeries ، ووقت التعرض 90 مللي ثانية لكل مستوى Z. ابدأ عملية الاستحواذ بالنقر فوق تشغيل، واسمح لها بتشغيلها لمدة 10 دقائق كاملة. يتم حفظ البيانات كسلسلة صور ، ويتم عرض مثال على نتيجة التصوير بفاصل زمني هنا.

ابدأ تحليل الصورة عن طريق فتح ImageJ وسحب مكدس الصور المكتسبة مباشرة إلى لوحة التحكم. ستبدأ التنسيقات الحيوية المستوردة تلقائيا. حدد حسنا"لتحميل مكدس الصور كمكدس فائق.

باستخدام وظيفة ZProject ، قم بطي كل zSeries في أقصى كثافة للإسقاط ثنائي الأبعاد. قم بتطبيق مرشح متوسط على مكدس الصور لتقليل تشويش البقع عن طريق تحديد قائمة العملية والقائمة الفرعية للمرشح وميزة الوسيط. أدخل 2.0 بكسل في مربع نصف القطر وانقر فوق حسنا "تحديد خلايا ما قبل NFA في الحقل.

تتميز هذه ببراعم متوسطة الحجم ومغزل انقسامي قصير يبلغ طوله حوالي نقطة إلى نقطة خمسة ميكرومترات. بدءا من النقطة الزمنية الأولى لسلسلة الصور ، استخدم أداة الخط المجزأ لرسم خط على طول أنبوب نجمي دقيق واحد من الموجود عند التقاطع بين الأنابيب الدقيقة النجمية ، والأنابيب الدقيقة للمغزل ذات العلامات الأكثر كثافة ، إلى النهاية الزائدة ، الموجودة في السيتوبلازم. انقر نقرا مزدوجا فوق نهاية الأنابيب الدقيقة لإكمال الخط المجزأ.

سجل القياس في جدول النتائج باستخدام ميزة القياس بالضغط على الزر M على لوحة المفاتيح. بعد إجراء القياسات لجميع النقاط الزمنية ، انسخ البيانات من جدول النتائج ، والصقها في جدول بيانات ، وحدد حفظ باسم"لتحديد البيانات. يعرض هذا الرسم سلسلة زمنية من ديناميكيات الأنابيب الدقيقة النجمية في خلية من النوع البري ، وسلالة متحولة تبين سابقا أنها تحتوي على أنابيب دقيقة أكثر استقرارا.

يتم تصنيف الأنابيب الدقيقة على أنها توبولين ألفا الموسوم ب GFP لتصور طول الأنابيب الدقيقة. تتبع الأسهم الحمراء الطول الإجمالي للأنابيب الدقيقة النجمية ، حيث تشير رؤوس الأسهم إلى نهايات الجمع. تم قياس أطوال الأنابيب الدقيقة في كل نقطة زمنية لمدة ثماني دقائق ، ويتم تصوير هذه الأطوال المجمعة في مخططات الحياة.

تشير النقاط الخضراء إلى البلمرة ، والنقاط الوردية تشير إلى إزالة البلمرة. يشار إلى أحداث الكوارث برؤوس الأسهم. تظهر هذه المؤامرات أن الأنابيب الدقيقة في الطفرة أطول ، وتظهر كوارث أقل من الأنابيب الدقيقة من النوع البري.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل معدلات البلمرة وإزالة البلمرة المحددة من منحدرات أطوال الأنابيب الدقيقة الصاعدة والهابطة في الطفرة مقارنة بالنوع البري. تكشف قياسات ديناميكيات الأنابيب الدقيقة أيضا أن الأنابيب الدقيقة في الخلية الطافرة قد انخفضت ديناميكيتها مقارنة بالنوع البري. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء إعداد الشريحة وتحميل الخلية والحصول على الصور في 30 دقيقة ، مما يعني أنه يمكن تصوير العديد من العينات المختلفة في يوم واحد.

يمكن صنع غرف الشرائح وتخزينها مسبقا قبل إضافة Concanavalin A.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت خلايا الخميرة في غرف الشرائح البسيطة ، والصورة بأربعة أبعاد ، وقياس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلايا الحية. بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة ، يمكن تعديل هذا الإجراء لقياس ديناميكيات البروتينات الأخرى المصنفة بالفلورسنت في خلايا الخميرة الحية عبر نطاقات زمنية تتراوح من ثوان إلى ساعات.