عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة في خلايا الخميرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الأنيبيبات الدقيقة، مثل كيفية قيام الطفرات في الأنيبيبات ومنظمات الأنيبيبات الدقيقة بتنظيم ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة في خلية حية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تثبيت خلايا الخميرة الحية في الصورة.

بدلاً من ذلك، دقة زمنية عالية لمدة عشر دقائق، أو دقة زمنية منخفضة لعدة ساعات. سيقوم بعرض الإجراء كل من Colby Fees وCassi Estrem، وهما طالبان في مرحلة الدراسات العليا من مختبري. وقد تم تعديل خلايا الخميرة المستخدمة في هذه التجربة للتعبير constitutively عن بروتين tubulin المسمى بـ GFP.

قم بتلقيح حوالي 1 µL من خلايا الخميرة من مستعمرة واحدة على طبق في 3 mL من الوسط الاصطناعي الكامل. اترك الخلايا تنمو طوال الليل عند 30 °C مع الرج بسرعة 250 RPM. في اليوم التالي، خفف المزرعة المشبعة لتصل قيمة OD600 إلى أقل من 0.1 في الوسط.

أعد المزرعة المخففة إلى الهزاز عند درجة حرارة 30 درجة Celsius لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات، أو حتى تصبح قيمة OD600 بين 0.4 و 0.8. ابدأ في تحضير شرائح حجرة التدفق عن طريق قص قطعة من فيلم البارافين بعرض أربع بوصات وطول سبع بوصات. ضع شريحة مجهرية قياسية بشكل طولي على عرض فيلم البارافين البالغ أربع بوصات، ولف الفيلم حول الشريحة من ثلاث إلى أربع مرات بحيث تكون الشريحة مغطاة بفيلم يتكون من ثلاث إلى أربع طبقات.

اضغط الطبقات معًا لضمان إحكام الغلق بشكل مناسب، مع تجنب الضغط بقوة مفرطة أو التسبب في تجعد الغشاء. باستخدام شفرة قاطع صناديق نظيفة، وشريحة أخرى لتوفير حافة مستقيمة للقص، قُم بقص غشاء البارافين على طول الحواف الخارجية للشريحة. انزع الغشاء الزائد من شريحة العمل وتخلص منه.

باستخدام الشريحة الثانية كحافة مستقيمة، قم بقص طبقات الفيلم المتراكمة على طول المحور الطولي للشريحة إلى ما يقرب من 10 شرائط، يتراوح عرض كل منها بين 2 إلى 4 ملم. بعد ذلك، قم بقص طبقات فيلم البارافين المتراكمة بشكل عمودي على القصات السابقة على طول المحور القصير للشريحة لإنشاء شرائط يتراوح عرضها من 2 إلى 4 ملم، وطولها من 23 إلى 24 ملم، وبسماكة تتراوح من 3 إلى 4 طبقات. استخدم شفرة حلاقة بزاوية 45 درجة لتقشير شرائط الفيلم المقصوصة.

بعد ذلك، استخدم الملاقط لتوزيع الشرائط المقطوعة بالتساوي على شريحة مجهرية نظيفة لإنشاء العدد المطلوب من الحجرات. في هذا المثال، سيتم استخدام أربعة شرائط فيلم لإنشاء ثلاث حجرات. ضع غطاء شريحة واحد فوق شرائط الفيلم، وحركه إلى موضعه باستخدام الملاقط.

ضع الشريحة المُحضرة، بحيث تكون غطاء الشريحة للأعلى، على لوح تسخين مضبوط عند حوالي 95 °C، وسخّن الشريحة لمدة ثلاث دقائق تقريبًا حتى تصبح شرائط الفيلم شفافة. قم بإغلاق الشريحة وغطائها معًا باستخدام ملاقط للضغط برفق على مناطق غطاء الشريحة التي تقع مباشرة فوق شرائط فيلم البارافين. استخدم الملاقط لإزالة الشريحة من لوح التسخين، وضعها جانبًا لتبرد مع توجيه جهة غطاء الشريحة للأعلى.

بينما تبرد الشريحة، سيعود الغشاء إلى تلون أبيض معتم. لبدء هذا الإجراء، قم بإذابة جزء مجمد بحجم 200 microliter من Concanavalin A في درجة حرارة الغرفة. أضف ما يقرب من 100 microliters من Concanavalin A المذاب إلى كل حجرة من حجرات الشريحة المجهزة عن طريق الماصة في أحد الطرفين المفتوحين.

ثم قم بتعليق الشريحة، بحيث يكون غطاء الشريحة لأسفل، بين حاملين لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمدة خمس دقائق للسماح لـ Concanavalin A بالالتصاق بغطاء الشريحة. أعد الشريحة إلى وضعية يكون فيها غطاء الشريحة لأعلى، وأزل Concanavalin A عن طريق غسل الغرفة باستخدام وسط اصطناعي كامل. قم بتمرير ضعف حجم الغرفة من الوسط عبر الغرفة باستخدام زاوية منشفة ورقية لسحب السائل من أحد طرفي الغرفة، مع إضافة سائل جديد في الوقت نفسه باستخدام الماصة في الطرف الآخر من الغرفة.

قم بتحميل الخلايا عن طريق تدفيع ضعف حجم الغرفة من معلق الخلايا باستخدام طريقة التدفق الموجه. علّق الشريحة، بحيث يكون غطاء الساحة للأسفل، لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالالتصاق بغطاء الساحة. اغسل أي خلايا غير ملتصقة عن طريق تدفيف أربعة أضعاف حجم الغرفة من الوسط الاصطناعي الكامل.

جفف كل طرف من أطراف الغرفة بعناية باستخدام زاوية نظيفة من منشفة ورقية، مع سحب السطح الهلالي للسائل حتى حافة غطاء الشريحة. أغلق كل طرف من أطراف الغرفة باستخدام مادة سادة دافئة. سيتم تنفيذ عملية الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب مجهز بعدسة شيئية CFI Plan Apo 100X بفتحة عددية (NA) تبلغ 1.45، ومنصة كهرضغطية (Piezoelectric stage)، ووحدة مسح متحد البؤر ذات قرص دوار، وليزر إضاءة، وكاميرا EMCCD.

حافظ على درجة حرارة المنصة عند درجة حرارة الغرفة أثناء عملية التقاط الصور. قم بضبط بؤرة الخلايا وابحث في الشريحة عن خلايا متجمعة معاً لضمان أن حقل الالتقاط يحتوي على خمس إلى ست خلايا على الأقل متجمعة في نفس المستوى البؤري. قم ببرمجة عملية التقاط متعددة الأبعاد لجمع عدة zSeries على مدار فترة زمنية.

اضبط الإعدادات ضمن إعدادات الاستحواذ النشطة على ما يلي: عمق Z إجمالي قدره 6 µm ليشمل خلية الخميرة بأكملها، وحجم خطوة Z قدره 300 nm لزيادة تجميع الضوء دون الإفراط في أخذ العينات، ومدة زمنية إجمالية قدرها 10 دقائق، وفواصل زمنية قدرها 4 ثوانٍ بين مجموعات zSeries، وزمن تعريض قدره 90 ms لكل مستوى Z. ابدأ عملية الاستحواذ بالنقر على Run، واتركها تعمل للمدة الكاملة البالغة 10 دقائق. يتم حفظ البيانات كسلسلة صور، ويظهر هنا مثال على نتيجة التصوير بفاصل زمني.

ابدأ تحليل الصور عن طريق فتح برنامج ImageJ وسحب مجموعة الصور المكتسبة مباشرة إلى لوحة التحكم. ستبدأ عملية استيراد Bio-Formats تلقائياً. اختر "Okay" لتحميل مجموعة الصور كـ hyperstack.

باستخدام دالة ZProject، قم بضغط كل zSeries إلى مسقط ثنائي الأبعاد لأقصى كثافة. قم بتطبيق مرشح وسيط على مجموعة الصور لتقليل ضوضاء التبقيع من خلال اختيار قائمة process، ثم القائمة الفرعية filter، وميزة median. أدخل 2.0 pixels في خانة نصف القطر (radius) وانقر موافق. "حدد الخلايا ما قبل NFA في الحقل.

تتميز هذه الخلايا ببراعم متوسطة الحجم ومغزل ميتوزي قصير يبلغ طوله حوالي 1 إلى 1.5 µm. بدءاً من النقطة الزمنية الأولى في سلسلة الصور، استخدم أداة الخط المقسم لرسم خط على طول أنبوب دقيق نجمي واحد، بدءاً من نقطة الالتقاء بين الأنبوب الدقيق النجمي وأنابيب المغزل الدقيقة الأكثر كثافة في الوسم، وصولاً إلى الطرف الموجب الموجود في السيتوبلازم. انقر نقراً مزدوجاً على نهاية الأنبوب الدقيق لإكمال الخط المقسم.

سجل القياس في جدول النتائج باستخدام ميزة القياس عن طريق الضغط على الزر M في لوحة المفاتيح. بعد إجراء القياسات لجميع النقاط الزمنية، انسخ البيانات من جدول النتائج، ثم الصقها في جدول بيانات، واختر "Save As" لتحديد البيانات. يعرض هذا الرسم البياني سلسلة زمنية لديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة النجمية في خلية من النوع البري، وسلالة طافرة ثبت سابقاً أنها تمتلك أنيبيبات دقيقة أكثر استقراراً.

يتم وسم الأنيبيبات الدقيقة باستخدام alpha tubulin الملحق بـ GFP لتصور طول الأنيبيبات الدقيقة. تتبع الأسهم الحمراء الطول الإجمالي لأنيبيبة دقيقة شعاعية، بينما تشير رؤوس الأسهم إلى النهايات الموجبة. تم قياس أطوال الأنيبيبات الدقيقة عند كل نقطة زمنية لمدة ثماني دقائق، وتظهر هذه الأطوال المجمعة في مخططات الحياة.

تشير النقاط الخضراء إلى البلمرة، وتشير النقاط الوردية إلى إزالة البلمرة. ويُشار إلى أحداث الكارثة برؤوس الأسهم. وتُظهر هذه المخططات أن الأنيبيبات الدقيقة في الطفرة تكون أطول، وتظهر كوارث أقل مقارنة بالأنيبيبات الدقيقة في النوع البري.

بالإضافة إلى ذلك، فإن معدلات البلمرة وإزالة البلمرة المحددة من منحدرات أطوال الأنابيب الدقيقة الصاعدة والهابطة تكون منخفضة في الطفرة مقارنة بالنوع البري. كما تكشف قياسات ديناميكيات الأنابيب الدقيقة أن الأنبوب الدقيق في الخلية الطافرة لديه ديناميكية منخفضة مقارنة بالنوع البري. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تحضير الشريحة، وتحميل الخلايا، والتقاط الصور في غضون 30 دقيقة، مما يعني إمكانية تصوير العديد من العينات المختلفة في يوم واحد.

يمكن تجهيز حجرات الشرائح وتخزينها مسبقاً قبل إضافة Concanavalin A. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت خلايا الخميرة في حجرات شرائح بسيطة، والتصوير رباعي الأبعاد، وقياس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الخلايا الحية. بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة، يمكن تعديل هذا الإجراء لقياس ديناميكيات البروتينات الأخرى الموّسمة فلوروسينياً في خلايا الخميرة الحية عبر نطاقات زمنية تتراوح من ثوانٍ إلى ساعات.