Name: قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: اكتشف طريقة الترسيب المشترك لقياس ارتباط البروتين بـ F-actin في دراسات الخلايا والكيمياء الحيوية. تتيح هذه التقنية تحديد قوة التفاعل باستخدام الطرد المركزي فائق السرعة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة HL127711 ل أفك.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

و أكتين المشارك الترسيب الفحص هو تقنية واضحة التي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين. مع بعض التعديلات، ويمكن أيضا أن تستخدم تقنية لقياس تقارب التفاعل. بالإضافة إلى النقاط التي أثيرت في البروتوكول أعلاه، ينبغي النظر في القضايا التالية عند تصميم وإجراء وتفسير الفحص. بروتين الفائدة بروتين الطازجة أو المجمدة يمكن استخدامها في الفحص. إذا تم استخدام البروتين المجمد، فمن المستحسن أن تتم مقارنة النتائج مع الطازجة (أبدا المجمدة) البروتين لضمان أن التجميد لا يؤثر F- أكتين ملزمة. مصدر أكتين G العديد من التجارب التكوير استخدام G- أكتين معزولة عن العضلات بسبب وفرة النسبية. هناك ثلاثة أنماط أساسية أكتين في الثدييات - ألفا، بيتا وجاما - التي هي مشابهة بشكل ملحوظ (&gt; 90٪ تسلسل إيدنتيتي واي). ومع ذلك، هناك اختلافات وظيفية بين إيزوتيبس 12 ، 13 . إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن يكون إيزوتيب G- أكتين المستخدمة في فحص ملزمة تطابق النمط الظاهري في الجسم الحي . على سبيل المثال، إذا اختبار البروتين أعرب في العضلات والهيكل العظمي، ألفا أكتين هو الخيار الافضل. إذا فحص البروتين أعرب في الخلايا الليفية، ينصح بيتا أكتين. استخدام فالويدين منذ فالويدين يربط F- أكتين، فإنه يمكن أن تتدخل أو حتى منع ربط بعض البروتينات ملزم F- أكتين (على سبيل المثال، كتل فالويدين كوفيلين من ربط خيوط أكتين) 14 . وهكذا، فالويدين ينبغي أن تستخدم بحذر والنتائج مقارنة مع عينات غير فالويدين المعالجة عندما يكون ذلك ممكنا. خلفية عالية ليس من غير المألوف للبروتينات إلى الرواسب في غياب F- أكتين ( الشكل 1A ، لا F- أكتين بيليه عينةق). ومع ذلك، يمكن لمستويات عالية من الترسيب الخلفية أن تخفي ترسيب الأكتين المشترك الحقيقي وتجعل من الصعب، إن لم يكن من المستحيل، تحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين أو لقياس تقارب التفاعل. إضافة بوليديكانول إلى المخزن المؤقت رد فعل (الخطوة 4.1) يمكن أن تقلل بشكل كبير من الخلفية، وهو حل سهل. إذا كان هذا لا يقلل من الخلفية، وضبط المخزن المؤقت رد فعل، تركيز الملح، و / أو درجة حرارة الحضانة قد يساعد. منحنى ملزم لتوليد منحنى ملزمة، فمن الضروري أن تختلف تركيز إما البروتين من الفائدة أو F- أكتين على مدى سلسلة من ردود الفعل. في الممارسة العملية، فإنه من الأسهل والأفضل للحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت وتختلف تركيز البروتين من الفائدة. الحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت (على سبيل المثال، 2 ميكرومتر) في مقايسة تكوير حدود محاصرة غير محددة في تركيزات أعلى من F- أكتين ويمنعإزالة البلمرة في تركيزات أقل من (0.5 ميكرومتر) من F- أكتين. يمكن منع إزالة البلمرة باستخدام فالويدين، على الرغم من أن هذا يدخل عامل تعقيد محتمل في النظام (انظر الخطوة 3.3 وما فوق). كما أن الحفاظ على F-أكتين عند تركيز ثابت يسمح لمقارنة (وتطبيع) بيليه F- أكتين عبر العينات وتحديد التجارب الفاشلة ( أي حيث يكون بيليه F- أكتين متغير بدرجة كبيرة، مما يمنع التحليل عبر التركيزات). وأخيرا، والحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت يسمح واحد لتحديد ما إذا كان ملزم خيوط أكتين تعاونية ( الشكل 1C ). مشبعة ملزمة كما هو الحال في جميع التجارب ملزمة، فمن الأهمية بمكان أن الربط إلى F- الأكتين مشبعة وأن تركيز البروتين زائد الهضاب F- أكتين ( الشكل 1C ). دون هضبة، فإنه ليس من الممكن لحساب ثابت التفكك ثابت ثابت. وهكذا، فإنهمن المهم أن تخطط بعناية لسلسلة التخفيف ليتم اختبارها ودائما تشمل تركيزات أعلى من البروتين ( أي، على الأقل 5- إلى 10 أضعاف أعلى من المتوقع K د ). تحليل ملزم من أجل الثوابت التفكك قياس أن تكون حاسمة، وينبغي إجراء الفحص باستخدام تركيز F- الأكتين الذي يسمح لتركيز مواقع ملزمة على F- أكتين للبروتين من الفائدة لتكون أقل بكثير من تقارب. للتحقق من ما إذا تم استيفاء هذا المعيار، تقدير تركيز مواقع الربط من B ماكس . على سبيل المثال، إذا كان [F- أكتين] 2 ميكرومتر و B ماكس = 0.5، ثم [مواقع ملزمة] ≈ 1 ميكرومتر. وينبغي أن يكون K d على الأقل من 5 إلى 10 أضعاف أكبر من [المواقع الملزمة]. إذا كان المقياس K d من نفس الحجم من حيث [المواقع الملزمة]، فمن الممكن أن يمثل منحنى ملاحظ لوحظ معايرة من عالية تقارب ملزمة سيتيس بدلا من إيسوثرم ملزمة حقيقية. إذا لوحظ هذا، كرر الفحص باستخدام انخفاض 10 أضعاف تركيز F- الأكتين لقياس تقارب دقيق. للتفاعلات عالية تقارب، فالويدين الاستقرار (الخطوة 3.3) قد يكون ضروريا لتحقيق تركيز F- أكتين منخفضة بما فيه الكفاية لقياس تقارب بدقة. وأخيرا، هناك قيود أساسية مع الفحص المشترك الترسيب أن الباحثين يجب أن يكون على بينة من عند إجراء وتقييم الفحص. الأهم من ذلك، فإن مقايسة الترسيب المشترك لا تنتج ثابت التوازن الحقيقي. يتم فصل المنتجات من ملزمة ( أي البروتين زائد F- أكتين) من المواد المتفاعلة أثناء الطرد المركزي، وعندها يمكن للمنتجات ثم فصل لخلق توازن جديد. ونتیجة لذلك، یمکن أن یخطئ مقیاس الترسیب المشترك أو یخفق في الکشف عن التفاعلات المنخفضة الألفة. منذ العديد من البروتينات المرتبطة أكتين لديها تقارب منخفض ( أي، ميكرومولار) ل F- أكتين، نتيجة سلبية ( <eم&gt; أي، لا يمكن الكشف عنها ملزمة) في الفحص لا يعني بالضرورة أن البروتين لا ربط F- أكتين. كبديل، تيرف القائم على الفحص المجهري، وفحوصات واحدة خيوط ملزمة هي أكثر حساسية وأكثر دقة لتحديد ثابت التفكك (للاستعراضات على هذه التقنية، انظر المراجع 15،16 ). وعلى الرغم من هذه القيود، فإن فحص التكوير هو ضمن وسائل معظم الباحثين، وهو أداة فعالة لتحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل.

أكتين هو بروتين الهيكل الخلوي الضروري الذي يلعب دورا حاسما في العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك الحركة، والانكماش، والتصاق، والتشكل 1 . أكتين موجود في شكلين: أكتين كروي أحادي (G- أكتين) وأكتين بلمرة خيطية (F- أكتين). داخل الخلايا، يتم التحكم في التنظيم F- أكتين من قبل مجموعة كبيرة من البروتينات التي تنظم تنوي، والنمو، عبر ربط وتفكيك شعيرات أكتين 2 ، 3 ، 4 . ومع ذلك، كيف العديد من البروتينات ملزمة أكتين تعمل في الحفل لتنظيم تنظيم شبكة أكتين لا يزال غير واضح إلى حد كبير. قياس التفاعلات البروتين البروتين هو نهج مهم لفهم كيفية بروتينات تمارس آثارها على السلوك الخلوي على مستوى الكيمياء الحيوية. العديد من المقايسات المختلفة يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات المنقى.وتشمل النهج المشتركة للبروتينات القابلة للذوبان سحب المنسدلة، الاستقطاب مضان، كالوريمتري المعايرة متساوي الحرارة، والرنين بلاسمون السطح. الأهم من ذلك، كل هذه المقايسات تتطلب البروتينات لتكون قابلة للذوبان، وبالتالي من الصعب على التكيف للاستخدام مع البوليمرية، والخيطية البروتين مثل F- أكتين. هنا، نحن تصف تقنية - أكتين المشارك الترسيب، أو التكوير، فحص - لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل. مقايسة التكوير أكتين هي تقنية بسيطة نسبيا التي لا تتطلب معدات متخصصة، وبصرف النظر عن نابذة فائقة السرعة. ويمكن إجراء جميع الكواشف، على افتراض معرفة الكيمياء الحيوية الأساسية، أو شراؤها. مرة واحدة ملزمة ل F- أكتين يتم تأسيسها، ويمكن استخدام مقايسة لقياس تقارب واضح ( أي ثابت التفكك التوازن) 5 . أيضا، مرة واحدة يتم تأسيس تقارب، فحص التكويرهو أداة مفيدة لقياس كيفية التغيرات في البروتين من الفائدة ( أي التعديلات بعد متعدية، الطفرات، أو يجند ملزمة) تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين 6 . تقنية لديها قيود (انظر المناقشة ) أن الباحث يجب أن يكون على بينة من قبل محاولة الفحص.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultra Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 الدوار</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي الفائق - 0.2 مل</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>الأكتين ، العضلات الهيكلية للأرانب</td><td>الهيكل الخلوي</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الألبومين</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>فالودين</td><td>ثيرموفيشر العلمي</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>ديثيوثريتول (DTT)</td> <td>ثيرموفيشر Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)</td> <td>سيجما</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>إيميدازول</td><td>فيشر Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)</td> <td>فيشر العلمي</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) فيشر</td> <td>سينتيفيك</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم (KCl)</td> <td>فيشر Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>الإيثيلين جلايكول مكرر (&بيتا ؛ أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N '، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) نظام</td> <td>التصوير Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant أزرق R-250 صبغ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>طقم تلطيخ أزرق غروي</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس البروتين ملزمة ل f- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

وينظم تنظيم أكتين الخيطية (F- أكتين) داخل الخلايا من قبل عدد كبير من البروتينات ملزمة أكتين التي تتحكم في تنوي الأكتين، والنمو، عبر ربط و / أو التفكيك. يصف هذا البروتوكول تقنية - الترسيب المشارك أكتين، أو التكوير، فحص - لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل ( أي ثابت التفكك التوازن). في هذه التقنية، يتم تحضين بروتين من الفائدة لأول مرة مع F- أكتين في الحل. ثم، يتم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لترسيب خيوط أكتين، ويتم تحليل المواد بيليتد بواسطة سدز-بادج. إذا كان البروتين من الفائدة يربط F- أكتين، وسوف يشارك في الرواسب مع خيوط أكتين. ويمكن قياس المنتجات من رد فعل ملزمة ( أي F- أكتين والبروتين من الفائدة) لتحديد مدى تقارب التفاعل. المقايسة أكتين التكوير هو تقنية واضحة لتحديدإذا كان بروتين من الفائدة يربط F- أكتين ولتقييم كيفية التغييرات في هذا البروتين، مثل يجند ملزمة، تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين.

فحصنا αE- كاتينين هوموديمر ملزمة ل F- أكتين في الفحص المشترك الترسيب. منذ التجارب السابقة أظهرت أن تقارب هوموديمير αE- كاتينين ل F- أكتين حوالي 1 ميكرومتر و B ماكس بالقرب 1 11 ، أجرينا الفحص مع تركيز منخفض من F- أكتين (0.2 ميكرومتر بدلا من 2 ميكرومتر، انظر المناقشة). منذ 0.2 ميكرومتر أقل من التركيز الحرج، وأضاف فالويدين لتحقيق الاستقرار في F- أكتين بلمرة من أرنب العضلات والهيكل العظمي G- أكتين (الخطوة 3.3). تم تحضين زيادة تركيزات هوموديمر αE- كاتينين (0.125-12.0 ميكرومتر) في وجود أو غياب 0.2 ميكرومتر F- أكتين. تم طرد العينات، وتم تحليل الكريات الناتجة ( الشكل 1A ). كما هو متوقع، هوموديمر αE- كاتينين المشارك الرسوبي مع F- أكتين فوق الخلفية ( الشكل 1A ، مقارنة عينات بيليه F- أكتين إلى لا F- أسالقصدير بيليه عينات). تم تشغيل بسا كسيطرة سلبية ( الشكل 1B ). تم قياس كمية البروتين وتآمر على البروتين الحر لحساب تقارب التفاعل ( الشكل 1C ). البيانات تآمر أفضل تناسب معادلة هيل. وكان K د المحسوب 2.9 ميكرومتر، وكان B ماكس 0.2، وكان معامل هيل (ح) 4.8. وهكذا، αE- كاتينين هوموديمر يربط F- أكتين بشكل تعاوني مع تقارب ميكرومولار منخفضة، بما يتفق مع العمل السابق (K د من 2.9 ميكرومتر مقابل ~ 1.0 ميكرومتر) 11 . <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> الشكل 1: عالية السرعة F- أكتين المشارك الترسيب الفحص. ( أ ) زيادة التركيز (0.125-12.0 ميكرومتر) من هوموديمر αE- كاتينين مع (لوحات اليسار) أو بدون (لوحات اليمنى) 0.2 ميكرومتر F- أكتين استقرت مع فالويدين. تم احتضانهم لمدة 30 دقيقة في رت والطرد المركزي. تم فصل مجموع (7.5٪ من المواد بدءا) والمواد بيليتد (50٪ من المواد بيليه) من قبل سدز-بادج وملطخة صبغ كوماسي. ( B ) تم تشغيل 4 ميكرومتر بسا كسيطرة سلبية. تم فصل مجموع وبيليه العينات، مع (+) أو بدون (-) F- أكتين، سدز-بادج وملطخة صبغ كوماسي. ( C ) ملزمة αE- كاتينين (μM / ميكرومتر أكتين) من A تم تآمر ضد αE- كاتينين الحرة (μM)، والبيانات تناسب معادلة هيل (الخط الأحمر). يتم سرد K د ، B ماكس ، ومعامل هيل (ح). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> الشكل 2: أكتين التكوير الكمي </sترونغ&gt; - الرسم البياني. ويوضح هذا التخطيطي الخطوات الرئيسية في القسم 5، مع أمثلة من عينات توتال وبيليه ( A ، سي) والمنحنى القياسي ( B ) المستخدمة في القياس الكمي. 5.13 الخطوات: 1 ) قياس كمية البروتين من الفائدة في مجموع العينات (A). 2 ) توليد منحنى القياسية عن طريق التآمر كثافة الفرقة مقابل كتلة البروتين (B). 3 ) قياس كمية البروتين من الفائدة التي شاركت في الرسوبيات مع F- أكتين ( C ). 4 ) قياس كمية البروتين من الفائدة التي بيليتد في غياب F- أكتين ( D ). 5 ) طرح D من C لتحديد كمية البروتين ملزمة F- أكتين. 6 ) قياس كمية F- أكتين في كل بيليه (E)، وحساب متوسط ​​كمية F- أكتين لكل عينة، وتقسيم كل عينة حسب المتوسط ​​(الأرقام أدناه تظهر النسبة). 7 )لكل عينة، وتقسيم كمية البروتين ملزمة (المحسوبة في الخطوة 5) من قبل F- أكتين بيليه نسبة (المحسوبة في الخطوة 6) لضبط الاختلافات في بيليه. 8 ) استخدام منحنى القياسية ( B ) لحساب كمية (كتلة) من البروتين ملزمة تطبيع في كل عينة (الخطوة 7). 9 ) تحديد تركيز البروتين الحرة والبروتين ملزمة لخلق منحنى ملزمة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

يصف هذا البروتوكول طريقة لاختبار قدرة البروتين للمشاركة في الرواسب مع أكتين الخيطية (F- أكتين)، وإذا لوحظ ملزم، لقياس تقارب التفاعل.

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

الهدف العام من هذه التقنية هو اختبار قدرة البروتين على الترسيب المشترك مع الأكتين الخيطي، وفي حال لوحظ حدوث الارتباط، يتم قياس ألفة هذا التفاعل. وتعد هذه الطريقة تقنية مباشرة لتحديد ما إذا كان البروتين يرتبط بـ F-actin. وتتمثل مزايا هذه التقنية في أنها لا تتطلب معدات متخصصة باستثناء جهاز الطرد المركزي الفائق، كما يمكن تحضير جميع الكواشف أو شراؤها.للبدء، قم بتحضير بروتين عالي النقاء كما هو موضح في البروتوكول النصي. حدد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاصية عند 280 nanometers. وقبل الاستخدام مباشرةً، قم بإجراء طرد مركزي سريع للبروتين لإزالة تجمعات البروتين غير الذائبة.إذا كانت الذوبانية تثير القلق، فقم بقياس تركيز البروتين مرة أخرى بعد عملية الطرد المركزي. بعد ذلك، أخرج كمية محددة من الأكتين الكروي أو g-actin من المجمد عند درجة حرارة -80 °C وأذبها بسرعة. أضف منظم بلمرة بتركيز 10X إلى G-actin ثم خففه بالماء للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1X.يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح للأكتين بالبلمرة. وبعد البلمرة، يُخزن الأكتين الخيطي المبلمر، أو F-actin، في محلول عند درجة حرارة 4 °C، حيث يظل مستقراً لبضع أسابيع. وقبل استخدام F-actin بعد التخزين، يتم قلب الأنبوب أو نقره بلطف عدة مرات لضمان ذوبان كل الأكتين وتوزيعه بشكل متجانس في المحلول.قم بتحديد ارتباط البروتين المستهدف بـ F-actin كما هو موضح في البروتوكول النصي. وبمجرد إثبات ارتباط F-actin، قم بتخفيف البروتين تسلسلياً لعمل سلسلة تركيزات تحتوي على سبع إلى ثمانِ عينات بتركيز يعادل ضعفي التركيز النهائي المراد اختباره. على سبيل المثال، إذا كان النطاق المطلوب اختباره من 0.1 إلى ثمانية micromolar، فقم بتحضير تخفيفات بتركيزات 16 و 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 و 0.2 micromolar من البروتين في 1X reaction buffer داخل أنابيب طرد مركزي دقيقة.قم بتخفيف البروتين المستهدف للوصول إلى التركيز النهائي في محلول منظم للتفاعل بتركيز 1X داخل أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق. أضف F-actin إلى العينات المناسبة. بعد ذلك، قم بتحضين جميع العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد مرور 30 دقيقة، يتم سحب خمس العينة من كل عينة وخلطها مع منظم العينات (sample buffer). تمثل هذه العينات الإجمالية. توضع أنابيب عينات جهاز الطرد المركزي الفائق في الدوار ويتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 100,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C.بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة ثلاثة أرباع السائل الطافي من كل أنبوب واخلطه مع منظم عينات (sample buffer) بتركيز 4X في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق منفصل. هذه هي عينات السائل الطافي. ثم قم بإزالة ما تبقى من السائل الطافي باستخدام طرف تحميل الجل، مع الحرص على عدم تحريك الراسب.بعد ذلك، أضف منظم عينات بتركيز 1X إلى جميع الأنابيب واتركها لتحضن لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، قم بعملية التثقيب (trituration) للعينة من ثمان إلى عشر مرات باستخدام رأس ماصة p200، مع غسل منطقة الراسب في الأنبوب باستمرار. قم بكشط الراسب برفق بواسطة رأس الماصة أثناء عملية التثقيب للمساعدة في إعادة التعليق.انقل البروتين المعاد تعليقه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. تمثل هذه العينات الراسب. وأخيرًا، قم بتحليل عينات المجموع والراسب بواسطة SDS page.قم بتصوير هلامات صبغة Coomassie باستخدام نظام تصوير يقيس كثافة نطاقات البروتين عبر نطاق واسع وخطي. تم تحضين تركيزات متزايدة من متجانس الثنائي (homodimer) لبروتين alpha e catenin في وجود أو غياب 0.2 micromolar من F-actin. تم إجراء طرد مركزي للعينات ومن ثم تحليل الرواسب الناتجة.كما كان متوقعاً، ترسب المتجانس ثنائي α-catenin مع F-actin بمستويات أعلى من الخلفية. استُخدم BSA كعنصر تحكم سلبي. تم قياس كمية البروتين المرتبط ورسمها مقابل البروتين الحر لحساب ألفة التفاعل.يمكن تنفيذ هذه التقنية في أربع ساعات أو أقل إذا كان F-actin مبلمراً بالفعل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من الضروري إزالة السائل الطافي بسرعة بعد عملية الطرد المركزي وإعادة تعليق الراسب بالكامل. وكما هو الحال في جميع تجارب الارتباط، من الضروري أن يكون الارتباط بـ F-actin مشبعاً وأن تصل درجة النقاء زائد F-actin إلى مرحلة الثبات؛ فبدون الوصول إلى هذه المرحلة من الثبات، لن يكون من الممكن حساب ثابت توازن الارتباط بدقة.هناك قيود أساسية في مقايسة الترسيب المشترك يجب أن يكون الباحثون على دراية بها، وأهمها أنها لا تعطي ثابت اتزان حقيقي، ونتيجة لذلك، قد تؤدي إلى حساب خاطئ أو الفشل في اكتشاف التفاعلات ذات الألفة المنخفضة. ورغم هذه القيود، تظل مقايسة الترسيب المشترك أداة ميسرة وفعالة لتحديد ما إذا كان البروتين يرتبط بـ F-actin ولقياس ألفة هذا التفاعل.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

البروتينات ربط أكتين الخيطية (F - أكتين) من خلال وحدات أكتين متميزة ملزمة. في هذا الفيديو نبدي الداخلي أكتين شارك في الترسيب ، وهو المختبر في فحص روتيني لتحليل البروتينات أو المجالات المحددة التي تربط F - أكتين.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

نحن نطبق التسمية خالية من تحليل التفاعل البروتين باستخدام X100 Biacore للهيكل وظيفة تحليل الربط العديد من المسوخ B cystatin إلى غراء من خلال توصيف الحركية. المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) يقيس تركيز البروتين مع النشاط ملزم الاحتفاظ دون الحاجة إلى منحنى القياسية. نظهر أن تأكيد باستخدام تركيزات CFCA يزيد من مصداقية هذا التحليل الحركي ويمكن أن يعتمد عليه أن يحدد الثوابت الحركية حتى إذا تم خفض نشاط بروتين المؤتلف.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تباين الخواص الفلورية لدراسة التفاعلات بين بروتين متلازمة شواكمان الماسية (SBDS) الموسوم بالفلوروفور وعامل الاستطالة الشبيه بعامل الاستطالة 1 GTPase (EFL1). عند احتضان بروتينات SBDS بتركيزات متزايدة تدريجيا من EFL1 ، لوحظت زيادة مطردة في تباين الخواص ، مما يشير إلى تفاعل ناجح بين البروتينين.

الكشف القائم على تباين الخواص الفلورية لتفاعلات البروتين والبروتين

بلمرة FtsZ ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير ، نقوم بتفصيل بروتوكولات بسيطة لمراقبة نشاط بلمرة FtsZ ومناقشة تأثير تكوين المخزن المؤقت. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة تفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية أو الأدوية المضادة للبكتيريا التي تؤثر على بلمرة FtsZ.

FtsZ البلمرة فحوصات: بروتوكولات بسيطة واعتبارات

يقارن هذا البروتوكول الصلات النسبية للشركاء الملزمين لعائلة Rho-family GTPases، بما في ذلك Rac1. في الجسم الحي ، تتنافس البروتينات المرتبطة ب Rac1 على واجهة ربط واحدة ، يتم إملاء شكلها بواسطة نيوكليوتيدات مرتبطة. النيوكليوتيدات مهمة ويصعب التحكم فيها تجريبيا ، بسبب ارتفاع معدل التحلل المائي.

مقارنة الانجذاب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة

تفاعلات البروتين هي في صميم وظيفة الخلية. وتستخدم تقنيات مقياس الكالوري والطيفية عادة لوصف لهم. نحن هنا وصف تباين مضان كأداة لدراسة التفاعل بين البروتين تحور في متلازمة شوان دايموند (SBDS) والاستطالة عامل مثل 1 GTPase (EFL1).

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

نقدم طريقه تجمع بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده التشكيل إلى أقراص البيتيغرافيه في خطوه واحده للكروماتوغرافي. وتستخدم السقالات الحيوية للحصول علي المرفق السطحي المباشر وقياس التفاعلات البروتينية والبروتينات عن طريق قياس التداخل الحيوي.

PeptiQuick ، خطوه واحده لدمج البروتينات الغشائية في أقراص البيتيلات الحيوية لاختبارات ربط البروتين الانسيابية

يصف هذا البروتوكول تكوين طبقات ثنائية دهنية مدعومة وإضافة خيوط هيكلية خلوية وبروتينات حركية لدراسة ديناميكيات الشبكات الهيكلية الخلوية المعاد تشكيلها والمربوطة بالغشاء باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

إعادة تكوين قشرة الأكتين الدنيا المربوطة بالغشاء على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة

يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج مذنبات الأكتين على أسطح الخرز باستخدام مكونات البروتين المتاحة تجاريا. تحاكي هذه الأنظمة الهياكل البارزة الموجودة في الخلايا ، ويمكن استخدامها لفحص الآليات الفسيولوجية لإنتاج القوة بطريقة مبسطة.

إعادة تكوين الحركة القائمة على الأكتين مع البروتينات المتاحة تجاريا

تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

اكتشف طريقة الترسيب المشترك لقياس ارتباط البروتين بـ F-actin في دراسات الخلايا والكيمياء الحيوية. تتيح هذه التقنية تحديد قوة التفاعل باستخدام الطرد المركزي فائق السرعة.

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

استكشف المزيد من الفيديوهات