A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميد الأنسجة العضلية عن طريق غمرها مباشرة في النيتروجين السائل مع التخلص من الشوائب الناتجة عن التجميد. سيقوم Maozhang He، وهو طالب من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء مع Yizhong Huang. للبدء، قم بتدوين هوية العينة على كل أنبوب تجميد.

بعد ذلك، قم بتجهيز المعدات التالية: خزان نيتروجين سائل، ونظارات واقية أو واقي للوجه، وقفازات تجميد، وملقط بطول 10 سنتيمتر، وملاقط بطول 25 سنتيمتر. قم أيضاً بتجهيز مبرد من الستايروفوم، وغشاء بلاستيكي، ومشرط، وأغطية تجليد PVC بمقاس A4. ولتحضير عينات العضلات، ابدأ بملء المبرد بالنيتروجين السائل.

في غضون خمس دقائق من الحصول على العينة، ضع العينة برفق على قطعة من غطاء تجليد PVC بمقاس A4، ولاحظ اتجاه الألياف العضلية. بعد ذلك، استخدم مشرطاً لإجراء شقين متوازيين عبر العينة في اتجاه الألياف العضلية، بطول 3 سنتيمترات تقريباً، وبمسافة 0.6 سنتيمتر بينهما. قم بتشذيب العضلة المقطوعة لتصبح على شكل مستطيل بعرض 0.6 سنتيمتر تقريباً، وارتفاع 0.6 سنتيمتر، وطول 1.5 سنتيمتر.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط بطول عشرة سنتيمتر، ضع العينة برفق على قطعة من الغشاء البلاستيكي بحيث يكون المحور الطولي للعضلة المشرّحة موازياً للحافة الطويلة للغشاء. ضع نسيج العضلة في الجزء السفلي الأوسط من أنبوبة تجميد مُصنفة، وتحديداً بين فتحات الإدخال، ثم أغلق سدادة الأنبوبة بإحكام. ولتجميد عينة النسيج، استخدم ملقطاً بطول 25 سنتيمتر لغمر أنبوبة التجميد بالكامل وبسرعة في النيتروجين السائل، داخل مبرد الستايروفوم المبرد مسبقاً، مع الانتظار حتى يتوقف النيتروجين السائل عن الغليان.

يجب أن تكون كمية النيتروجين السائل كافية لغمر الأنبوب المبرد بالكامل، كما يجب أن يكون الأنبوب المبرد تحت مستوى السائل تماماً. انقل عينات العضلات إلى خزان تخزين النيتروجين السائل، أو إلى مجمد بدرجة حرارة 80- درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. ومن المهم تجنب التلامس العرضي بين العضلات المجمدة والحاويات أو الأدوات التي تكون في درجة حرارة الغرفة.

لتحضير الشرائح، قم بتبريد الميكروتوم بالتجميد (cryostat) مسبقاً لدرجة حرارة تتراوح بين 20 degrees celsius و 22 degrees celsius. قم بإزالة شفرة الميكروتوم القديمة والتخلص منها، وامسح حامل السكين ولوحة منع التدحرج في جهاز الـ cryostat. بعد ذلك، قم بتركيب شفرة ميكروتوم جديدة في جهاز الـ cryostat، واضبط سمك القطع على ثمانية micrometers.

أخرج الأنبوب المبرد الذي يحتوي على عينة العضلة من خزان تخزين النيتروجين السائل، أو من المجمد عند درجة حرارة 80- درجة مئوية، وضعه في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف. بعد ذلك، انقل العينة إلى جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat)، وانتظر لمدة 30 دقيقة حتى تتوازن درجة حرارة العينة مع درجة حرارة الجهاز. بعد استخدام مركب OCT لتضمين العينة، قم بتثبيت العينة في حامل العينات.

بعد ذلك، قم بقطع مقاطع بسمك ثمانية ميكرومتر. ثبّت المقاطع باتجاه مركز شريحة مجهرية في درجة حرارة الغرفة. ضع الشريحة على الفور في صندوق شرائح.

بعد ذلك، ضع صندوق الشرائح في مجمد عند درجة حرارة 80- °C. لا تسمح للشريحة بأن تجف في درجة حرارة الغرفة. كما هو موضح هنا، تكونت بلورات ثلجية عندما وُضعت عينة من عضلة longissimus dorsi من الخنازير مباشرة في مجمد عند درجة حرارة 80- °C، مما أدى إلى حدوث "تأثير الجبن السويسري" المعروف في المقطع العرضي المجمد للعضلة.

تكونت بلورات جليدية أيضاً عندما غُمرت الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل. وباستخدام طريقة أخرى، تكونت العديد من البلورات الجليدية الشبيهة بالإبر في الحيز السيتوبلازمي للألياف العضلية عند غمس النسيج في وسط التثبيت OCT بالاتجاه الصحيح، ثم تجميده بسرعة في ملاط من الإيزوبنتان. ويحقق تجميد النسيج داخل الأنبوب المبرد متعدد الثقوب سلامة ممتازة للعينة، مع حيز سيتوبلازمي واضح الرؤية وتقارب وثيق للألياف العضلية مع الأنسجة المحيطة.

باستخدام هذه الطريقة، تم تحليل نشاط ATPase في الألياف العضلية سريعة الانقباض وبطيئة الانقباض. وعند إعطاء أوقات متكافئة، تظهر الألياف سريعة الانقباض فاتحة اللون، بدرجتين، بينما تظهر الألياف بطيئة الانقباض باللون الأسود. وفي طريقة التجميد القياسية الموضحة هنا، غُمست الأنسجة العضلية في ملاط من isopentane دون تلامس مباشر مع وسط التثبيت OCT، ومع ذلك، يصعب الحفاظ على حالة الملاط السائل الصلب لـ isopentane لأكثر من ساعة واحدة، كما أن isopentane ليس متاحاً دائماً.