A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميد أنسجة العضلات ، عن طريق غمرها مباشرة في النيتروجين السائل مع التخلص من القطع الأثرية المتجمدة. Maozhang He ، طالب من مختبري ، سيوضح هذا الإجراء مع Yizhong Huang. للبدء ، قم بتسمية هوية العينة على كل قارورة مبردة.

بعد ذلك ، قم بتنظيم المعدات التالية:خزان من النيتروجين السائل ، نظارات أمان أو درع للوجه ، قفازات تجميد ، ملقط 10 سم ، ملاقط 25 سم. أيضا ، قم بتنظيم مبرد الستايروفوم ، وفيلم بلاستيكي ، ومشرط ، وأغطية ربط A4 PVC. لتحضير عينات العضلات ، ابدأ بملء المبرد بالنيتروجين السائل.

في غضون خمس دقائق من الحصول على عينة ، ضع العينة برفق على قطعة من غطاء ربط A4 PVC ، وراقب اتجاه ألياف العضلات. بعد ذلك ، استخدم مشرطا لعمل شقين متوازيين عبر العينة في اتجاه ألياف العضلات ، بطول 3 سم تقريبا ، ومسافة 0.6 سم. قم بقص العضلة المقطوعة إلى مستطيل بعرض 0.6 سم تقريبا ، وارتفاعه 0.6 سم ، وطوله 1.5 سم.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط يبلغ طوله عشرة سنتيمترات ، ضع العينة برفق على قطعة من الفيلم البلاستيكي مع المحور الطولي للعضلة المقطوعة الموازية للحافة الطويلة للفيلم. ضع الأنسجة العضلية في المنتصف السفلي من قارورة مبردة تحمل علامة ، بين فتحات المدخل مباشرة ، وقم بتغطية القارورة بإحكام. لتجميد عينة الأنسجة ، استخدم ملاقط 25 سم لغمر القارورة المبردة بالكامل بسرعة في النيتروجين السائل ، في مبرد الستايروفوم المبرد مسبقا ، في انتظار حتى يتوقف النيتروجين السائل عن الغليان.

يجب أن يكون النيتروجين السائل كافيا لغمر المبردة بالكامل ، ويجب أن تكون القارورة المبردة أقل تماما من مستوى السائل. انقل عينات العضلات إلى خزان تخزين النيتروجين السائل ، أو فريزر 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. من المهم تجنب التلامس العرضي بين العضلات المجمدة والحاويات أو الأدوات بدرجة حرارة الغرفة.

لتحضير الشرائح ، قم بتبريد ناظم البرد مسبقا إلى ما بين 20 درجة مئوية و 22 درجة مئوية. قم بإزالة شفرة الميكروتون القديمة والتخلص منها ، وامسح حامل السكين واللوحة المضادة للانزلاق في ناظم التبريد. بعد ذلك ، قم بتثبيت شفرة ميكروتون جديدة في ناظم التبريد ، واضبط سمك القطع على ثمانية ميكرومترات.

قم بإزالة القارورة المبردة مع عينة العضلات من خزان تخزين النيتروجين السائل ، أو الفريزر 80 درجة مئوية ، وضعها في النيتروجين السائل ، أو على الثلج الجاف. بعد ذلك ، انقل العينة إلى ناظم التبريد ، وانتظر 30 دقيقة حتى تتوازن العينة مع درجة حرارة الناظم البريدي. بعد استخدام OCT لتضمين العينة ، قم بتركيب العينة في حامل العينة.

ثم قطع ثمانية أقسام ميكرومتر. قم بتركيب الأقسام باتجاه مركز شريحة صغيرة بدرجة حرارة الغرفة. ضع الشريحة على الفور في مربع شريحة.

ثم ضع صندوق الشرائح في فريزر 80 درجة مئوية. لا تدع الشريحة تجف في درجة حرارة الغرفة. كما هو موضح هنا ، تشكلت بلورات الجليد عندما تم وضع عينة من العضلة الظهرية الطويلة من الخنازير مباشرة في ثلاجة 80 درجة مئوية ، وتسببت في تأثير الجبن السويسري المعروف على قسم العضلات بالتبريد.

تشكلت بلورات الثلج أيضا عندما تم غمر الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل. باستخدام طريقة أخرى ، تشكلت العديد من بلورات الثلج الشبيهة بالإبرة في الحجرة السيتوبلازمية للألياف العضلية عندما تم غمس الأنسجة في وسط تركيب OCT في الاتجاه الصحيح ، ثم تم تجميدها بسرعة في ملاط من الأيزوبنتان. يحقق تجميد الأنسجة في التبريد متعدد الثقوب سلامة ممتازة للعينة ، مع حجرة سيتوبلازمية مرئية بوضوح ووضع محكم للألياف العضلية على الأنسجة المحيطة.

باستخدام هذه الطريقة ، تم تحليل نشاط ATPase في ألياف عضلية سريعة الانقباض وبطيئة الانقباض. عند إعطاء أوقات مكافئة ، تظهر الألياف سريعة الانقباض خفيفة ، بدرجتين ، وتظهر الألياف بطيئة الانقباض باللون الأسود. في طريقة التجميد القياسية الموضحة هنا ، تم غمر الأنسجة العضلية في ملاط من الأيزوبنتان دون اتصال مباشر بوسط تركيب OCT ، ولكن يصعب الحفاظ على حالة الملاط السائل الصلب للأيزوبنتان لأكثر من ساعة واحدة ، والأيزوبنتان غير متاح دائما.