تقييم الابتدائي الانفجار آثار في المختبر

الهدف العام من هذه الطريقة هو توليد موجات صدمة تمثيلية يمكن أن تحدث أثناء أحداث الانفجار وتقييم تأثير هذه الصدمة الميكانيكية على بقاء الخلايا الأولية في الثقافة. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة باستجابة أنواع الخلايا الفردية لأحداث الطاقة العالية مثل التعرض لموجة الصدمة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تمكننا من تقييم استجابات الخلايا المميزة لموجة صدمة واحدة على عكس استجابات مستوى الأنسجة أو الأعضاء.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحديد الآليات الخلوية التي تغيرت نتيجة لإصابات الانفجار الأولية ، والتي تحدث بسبب التعرض لموجة صدمة. على الرغم من أن هذه الطريقة يتم إظهارها مع نوع معين من الخلايا ذات الأهمية ، إلا أنه يمكن زراعة أي خلايا ووضعها في إعداد الاختبار لتقييم الاستجابات الخاصة بالخلية لموجة الصدمة. للبدء ، قم بزراعة خط الخلية محل الاهتمام في الثقافة القياسية حتى تصل إلى التقاء 80٪.

ثم استنشق الوسط. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وأضف ملليلترين من Trypsin-EDTA. احتضنها في ظروف الاستزراع القياسية لمدة خمس دقائق.

تحقق لفترة وجيزة للتأكد من أن الخلايا قد انفصلت بنجاح عن القارورة. ثم أضف أربعة ملليلتر من FBS الذي يحتوي على وسط مزرعة إلى القارورة من أجل تحييد التربسين ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للخلايا عند 200 مرة جم لمدة أربع دقائق لتكسير الخلايا.

بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية ببطء مع الحرص على عدم إزاحة الحبيبات. وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المتوسط. ضع ثلاثة أطباق تحمل علامة 35 ملليلتر داخل طبق سعة 90 مل.

ثم أضف ملليلترين من الوسط إلى كل طبق وبذرها 70 ألف خلية. احتضان الخلايا طوال الليل للسماح بارتباط الخلية بشكل كاف قبل تعريضها لموجة الصدمة. قبل البدء في تجميع أنبوب الصدمة ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك أحذية العمل ذات الأصابع الفولاذية ومعطف المختبر.

ابدأ بإدخال قضيبين للمحاذاة من خلال فتحات البراغي الموجودة في المستوى الأفقي لشفة المخرج. بعد ذلك ، ضع لوح حشية مطاطي من النتريل فوق نهاية قضبان المحاذاة بحيث يقع بين شفة المخرج وجهاز ثقافة الأعضاء خارج الجسم الحي. قم بتوصيل جهاز EVOC بشفة مخرج أنبوب الصدمة عن طريق تحريك التركيبات فوق قضبان المحاذاة.

تأكد من توجيهه بشكل صحيح بحيث يكون القسم الذي يحمل طبق بتري في قاعدته. بعد ذلك ، أدخل أربعة مسامير وغسالات M24 في الفتحات المتبقية وقم بربط الصواميل والمسامير بإحكام بالتتابع بطريقة متماثلة قطريا ، مع التحقق بصريا من محاذاة جهاز EVOC وأنبوب الصدمات بنجاح. بعد ذلك ، قم بتوصيل محول ضغط بجهاز EVOC وقم بتوصيله بالمصدر الحالي باستخدام كابل مستشعر.

بالإضافة إلى ذلك ، استخدم كبل BNC لتوصيل المصدر الحالي براسم الذبذبات. تأكد من إغلاق جميع صمامات التحرير وأدوات التحكم في التدفق على أنبوب الصدمة. بعد ذلك ، افتح شركة الطيران الخارجية المضغوطة المدمجة وأدر منظم الضغط يدويا في اتجاه عقارب الساعة لشحن الملف اللولبي إلى 2.5 بار.

افتح أسطوانة الهواء المضغوط، ثم أدر منظم الضغط ببطء في اتجاه عقارب الساعة لزيادة الضغط إلى 15 بار تقريبا. بعد ذلك ، قم بإعداد الأغشية عن طريق تقطيع لوح بلاستيكي بسمك 0.125 مليلتر إلى مربعات 10 سم × 10 سم. قم بإنشاء مقابض من الشريط اللاصق ، وقم بتثبيتها في أعلى وأسفل الحجاب الحاجز.

استخدمها لوضع الحجاب الحاجز بعناية بجوار الحافة الأمامية الصغيرة بجوار حجرة المؤخرة. تأكد من أن الحجاب الحاجز مستقيم ووضعه بشكل صحيح قبل إغلاق المؤخرة. ثم قم بتثبيته في مكانه باستخدام أربعة مسامير وصواميل M24.

داخل الغطاء المعقم ، قم بإعداد أغشية نفاذة للغاز اللاصق بحيث يكون كل منها كبيرا بما يكفي لتغطية الجزء العلوي من طبق بتري سعة 35 مل. بعد ذلك ، انقل طبق بتري سعة 90 مليلتر يحتوي على ثلاث عينات تجريبية إلى الغطاء. استنشق الوسط من أحد الأطباق ، وقم بتغطيته بقسمين غشائيين ، مع التأكد من وجود ختم محكم بين الغشاء وحافة الطبق.

انقل العينة إلى جهاز EVOC وقم بتثبيتها في قاعدة التركيبات بحيث يتم محاذاة الجزء العلوي من الطبق مع القاعدة الداخلية لأنبوب الصدمة. في هذه المرحلة ، ضعيها على مدافعات الأذن ونظارات العين وأحذية السلامة ومعطف المختبر. اضغط على نظام أنبوب الصدمات عن طريق تدوير مقبض التحكم في التدفق على المنظم في اتجاه عقارب الساعة.

في الجزء السفلي من لوحة التحكم ، حدد إما مدخل المؤخرة المزدوج لموجة صدمة قصيرة المدة ، أو مدخل أنبوب السائق لزيادة مدة الموجة. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصدر طاقة التيار المستمر وراسم الذبذبات لطلب بيانات شكل الموجة. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصابيح الأمان باستخدام المفتاح الموجود على الحائط المقابل للوحة التحكم لإخطار الباحثين الآخرين بعدم دخول الغرفة عند شحن أنبوب الصدمة.

في صندوق التحكم في الملف اللولبي، اضغط على المفتاح لإغلاق الملف اللولبي. بعد ذلك ، على لوحة التحكم ، افتح التحكم في التدفق ببطء عن طريق تدوير المقبض عكس اتجاه عقارب الساعة لزيادة الضغط تدريجيا داخل حجرة الضغط. عندما يتم الوصول إلى ضغط انفجار الحجاب الحاجز ، سوف يتمزق الحجاب الحاجز وسيتم سماع دوي انفجار.

بمجرد سماع هذه الضوضاء، أغلق مقبض التحكم في التدفق بسرعة. بعد ذلك ، افتح الملف اللولبي عن طريق إيقاف تشغيل المفتاح الموجود في صندوق التحكم في الملف اللولبي ، وقم بإطفاء ضوء الأمان. نقل عينة الخلية إلى غطاء المحرك المعقم.

هناك ، قم بإزالة الغشاء اللاصق المنفذ للغاز ، واملأ الطبق بملليلترين من وسط النمو الطازج. أضف 200 ميكرولتر من كاشف مؤشر الأكسدة والاختزال إلى كل طبق تجريبي مباشرة بعد إعادة تعبئتها بملليلترين من وسط النمو الطازج. ثم انقل الطبق إلى حاضنة قياسية لمدة أربع ساعات.

بعد الحضانة ، انقل قطعتين سعة 100 ميكرولتر من كل طبق إلى طبق مناسب مكون من 96 بئرا. اقرأ اللوحة على قارئ لوحة مضان ثم قم بتصدير البيانات وحفظها. للتصوير الفلوري للخلايا الحية والميتة ، يجب طلاء الخلايا في البداية على غطاء زجاجي داخل ألواح الثقافة سعة 35 مل.

بعد العلاج بالموجات الصدمية ، قم بشفط الوسط ، واغسل الخلايا مرتين في مليلتر واحد من PBS. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من الكاشف الحي الميت من مجموعة التصوير إلى كل عينة. واحتضان الخلايا والكاشف في درجة حرارة الغرفة ، وحمايته من الضوء لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الكاشف ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ملليلتر واحد من PBS. باستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة زلة الغطاء بعناية من الطبق سعة 35 مليلتر وضعها ووجهها لأسفل على شريحة مجهرية زجاجية. احصل على صور لكل عينة باستخدام مجهر فلوري مزود بعدسة موضوعية 5X بفتحة عددية تبلغ 0.25.

بعد ذلك ، استخدم برنامج تحليل الصور لحساب عدد الخلايا الخضراء الحية والخلايا الميتة الحمراء يدويا أو تلقائيا من كل صورة. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، تعرضت الخلايا المزروعة في طبقة أحادية لموجات الصدمة المتولدة بواسطة أنبوب الصدمة. تعرض المستشعرات الموجودة في أنبوب الصدمة ملفات تعريف الضغط التي لوحظت في مواقع مختلفة على طول الأنبوب.

باستخدام مقايسة مؤشر الأكسدة والاختزال ، وجد أن تطبيق موجة صدمة 127 كيلو باسكال كان قادرا على تقليل قابلية خلايا الحليمة الجلدية بشكل كبير مقارنة بالضوابط بعد 24 ساعة في الثقافة. لم يقلل تطبيق موجة الصدمة التي تبلغ 72 كيلو باسكال أو أقل من قابلية البقاء. لدعم هذه الملاحظات ، أظهر اختبار الموتى الأحياء أيضا انخفاضا في صلاحية الخلية لدى أولئك الذين تعرضوا لموجة الصدمة البالغة 127 كيلو باسكال عند مقارنتها بعنصر التحكم.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية بسرعة متغيرة بمعدل 60 عينة في الساعة. يمكن استخدام أنبوب الصدمة لتوليد موجات الصدمة لاستكشاف مجموعة من إصابات الانفجار الأولية. يمكن أن تتراوح هذه من الرئة الانفجارية إلى التعظم غير المتجانس ، وهو التكوين غير المناسب للعظام داخل الأنسجة الرخوة في الجسم.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر المخاطر التي تنطوي عليها عند العمل مع الغازات المضغوطة وموجات الصدمة عالية الطاقة ، واتباع إرشادات السلامة الصحيحة دائما. يمكن أن تمكننا التعديلات الطفيفة في أنبوب الصدمة من تغيير موجة الصدمة. يمكننا بعد ذلك تقييم الاستجابة الخلوية لملفات تعريف وشدة الضغط المختلفة ، والتي تمثل سيناريوهات انفجار مختلفة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تسلسل الجيل التالي للإجابة على أسئلة بحثية إضافية ، مثل ، كيف يغير التعرض لموجة الصدمة نقشنا الطبيعي داخل الخلايا؟