تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل التعبير عن الجينات وعلامات البروتين ، على التوالي ، للتمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية للفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد الآلية المسؤولة عن تثبيط التمايز العصبي حسب العمر الخام ل DPAs ، وتؤدي إلى بروتوكولات أفضل لتفريق الخلايا الجذعية إلى خلايا عصبية لأغراض علاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل تتبع عملية التمايز العصبي على مستويات الإيميرين والبروتين ، بما في ذلك عن طريق الفحص المجهري البصري.

سيوضح الإجراء الدكتور جونينغ يانغ ، باحث مشارك في مختبري. ابدأ تكوين الجسم الجنيني عن طريق حصاد الخلايا الجذعية الجنينية بنسبة 0.25٪ Trypsin-EDTA لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أضف Dulbecco's Medium المعدل من Iscove الطازج ، أو IMDM ، مع 15٪ FBS إلى الخلايا المنفصلة ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

جهاز طرد مركزي عند 160 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، وقم بإعداد خمسة × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تعليق مليلتر في IMDM مع 0.5 ميكرومولار حمض الريتينويك. بعد ذلك، استخدم ماصة ثماني القنوات وأطراف سعة 200 ميكرولتر لطلاء قطرات سعة 120 ميكرولتر لكل طبق بتري سعة 100 ملم.

اقلب الطبق واملأ الغطاء المقلوب ب PBS لمنع القطرات المعلقة من الجفاف. استزراع عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. استخدم أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر لحصاد الأجسام الجنينية المتدلية المتساقطة المزروعة لمدة ثلاثة أيام.

المس جسما جنينيا بطرف ماصة ، وانقله إلى زلة غطاء مطلية بالألياف في صفيحة من 24 بئرا. قم بتغيير الوسيط على الثقافات كل يومين إلى ثلاثة أيام. عند تغيير الوسيط ، اجمع الوسط المستخدم لتحليل إفراز البروتين حسب الحاجة.

للكشف عن البروتينات المفرزة في الوسط ، انقل 500 ميكرولتر من وسط الجسم الجنيني إلى مرشحات الطرد المركزي المقطوعة 10 كيلوڈالتون ، وتدور عند 20،000 × جم عند أربع درجات مئوية. افحص الوسط المتبقي داخل مرشحات الطرد المركزي كل 15 إلى 20 دقيقة لمنع التخصيب المفرط. أوقف الطرد المركزي عندما ينخفض حجم الوسط المتبقي إلى 25 ميكرولترا.

اقلب الفلتر وقم بالدوران عند 160 × جم عند أربع درجات مئوية ، ثم اجمع الوسط المركز المتبقي باتباع تعليمات الشركة المصنعة. للحصول على ثقافة ثلاثية الأبعاد، قم بحصاد الأجسام الجنينية المزروعة لمدة أربعة أيام كقطرات معلقة بأطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر، كما كان من قبل. انقل 30 جسما جنينيا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر ، ثم قم بإعداد محلول هلام الكولاجين عن طريق تخفيف الكميات المناسبة من محلول الكولاجين و 5X DMEM ، وإضافة محلول التحييد ، والخلط جيدا على الفور.

ضع جل الكولاجين على الثلج. بعد ذلك، قم بإدخال كمية مناسبة من محلول الكولاجين المبرد في الأنبوب الذي يحتوي على الأجسام الجنينية، ثم قم بسحب معلق الجسم الجنيني برفق في آبار صفيحة مكونة من ستة آبار دون تكوين فقاعات. انقل اللوحة على الفور إلى 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 60 دقيقة لبدء بلمرة الكولاجين.

بعد 60 دقيقة ، قم بتراكب اللوحة التي تحتوي على الأجسام الجنينية باستخدام IMDM. لتفكك الجسم الجنيني، اجمع مرة أخرى الأجسام الجنينية المعلقة لمدة أربعة أيام بأطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر. هذه المرة ، انقلها إلى طبق بتري بكتريولوجي غير لاصق يحتوي على IMDM مع 15٪ FBS وزراعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة أربعة أيام أخرى.

افحص الأجسام الجنينية مرتين يوميا للتأكد من أنها لا تلتصق بالقاع. رج الطبق برفق لمنع التصاق الجسم الجنيني. بعد أربعة أيام ، انقل الأجسام الجنينية إلى أنبوب طرد مركزي وجهاز طرد مركزي عند 185 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية. يجب ألا يتجاوز حجم اللوحة 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، ماصة مليلتر واحد من 0.25٪ من النوع الأول من الكولاجيناز ، مكملة بنسبة 20٪ FBS في PBS في أنبوب الأجسام الجنينية.

احتضان الخليط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتمرير التعليق برفق باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد كل 20 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام PBS.

في حالة وجود مجاميع الخلايا ، استخدم مصفاة خلوية بشبكة 100 ميكرون لإزالتها. قم بوضع الخلايا على زلات الغطاء المطلي بالجيلاتين في IMDM ، ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. اغسل الأجسام الجنينية ثنائية الأبعاد أو 3D المنفصلة باستخدام PBS.

ثم قم بإصلاحه باستخدام أربعة بالمائة بارافورمالدهيد و PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة حطام الخلية العائمة ، أضف 1٪ triton X-100 في PBS لاختراق الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل كما كان من قبل ، قم بإزالة الغسيل الأخير والحظر باستخدام 5٪ BSA في PBS لمدة 30 دقيقة.

قرب نهاية الحضانة ، قم بإعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA في PBS مكمل بنسبة 0.03٪ triton X-100. عند انقضاء 30 دقيقة ، استبدل محلول الحجب بمحلول الجسم المضاد الأساسي. احتضن لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة ، أو طوال الليل ، عند أربع درجات مئوية.

بعد الغسيل ، ضع جسما مضادا ثانويا في PBS واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، ينزلق غطاء التثبيت على الشرائح الزجاجية مع وسيط مضاد للبهتان للفحص المجهري البصري. تظهر هذه الصورة ظهور البرعم من جسم جنيني متولد من ESCs ، إيجابي لنسختين من جين Syx ، الذي يرمز لعامل تبادل الجوانين الذي ينشط GTPase RhoA.

تم التقاط الصورة بعد ستة أيام في ثقافة ثلاثية الأبعاد. يوضح هذا الجسم الجنيني المكون من Syx KnockOut ESCs زيادة الإنبات بعد نفس الوقت في الثقافة. هنا ، تظهر صور الطور لحواف الجسم الجنينية ثنائية الأبعاد أن الخلايا توسعت بشكل أسرع من Syx KnockOuts مقارنة بالنوع البري Syx.

توضح صور التألق المناعي هذه أن علامة التمايز العصبي ، Nestin ، الموضحة باللون الأحمر ، كانت أكثر وفرة في الخلايا التي تتوسع من الأجسام الجنينية 2D6 KnockOut لمدة ستة أيام مقارنة بنظيراتها من النوع البري Syx. هنا ، تظهر صور التألق المناعي أن علامات التمايز العصبي Nestin و beta III Tubulin كانت أكثر وفرة في الخلايا المنفصلة عن الأجسام الجنينية 3D6 KnockOut لمدة 13 يوما مقارنة بنظيراتها من النوع البري Syx. هذا إجراء يستغرق وقتا طويلا بسبب مدة نمو الجسم الجنيني وتمايزه.

لا يتطلب الأمر ثمانية أيام على الأقل فحسب ، بل في بعض الحالات نتبع التمايز حتى 24 يوما. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحد من جدوى قطر الجسم الجنيني لضمان معدلات تمايز مماثلة على طول الأجسام الجنينية.