مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة خنفساء الدقيق الحمراء الأجنة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو مراقبة تطور أجنة Tribolium castaneum بشكل غير جراحي على مدى فترات طويلة جدا من الزمن. يساعد الفحص المجهري الفلوري القائم على الورقة الخفيفة على الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتشكل في الكائن الحي النموذجي للحشرات الناشئ Tribolium castaneum الذي يعالج أنماط هجرة الخلايا وتكاثرها من الأديم الأريمي المبكر إلى بداية الحركة العضلية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن العوامل الحاسمة مثل التبييض الضوئي والسمية الضوئية يتم الاحتفاظ بها إلى الحد الأدنى حتى عند ملاحظة الأجنة لعدة أيام.

لتركيب جنين في غرفة العينة باستخدام عمود الاغاروز ، املأ أولا حقنة ملليمتر واحد بالماء المقطر واستخدم خرطوما مطاطيا صغيرا لربط المحقنة بشعرية زجاجية. املأ الشعيرات الدموية في منتصف الطريق بالماء المقطر ثم استخدم فرشاة طلاء لنقل الجنين إلى الجانب الداخلي من الفتحة الشعرية الزجاجية ، وألصق الشعيرات الدموية في الاغاروز السائل ، واسحب ببطء بضعة ميكرولترات من الاغاروز مع الجنين في الشعيرات الدموية. عندما يكون الجنين في مكانه ، يجب أن يكون هناك بضعة ميكرولترات من الاغاروز فوق الجنين وأسفله.

عندما يصلب الاغاروز ، قم بتقصير الشعيرات الدموية إلى طول حوالي خمسة ملليمترات. يجب ملء الجزء المتبقي بالكامل بالأغروز ويجب العثور على الجنين داخل الربع الثاني. ثم أدخل الأسطوانة الفولاذية مع الدبوس في غرفة العينة ، وألصق الجزء الشعري أعلى الدبوس ، يجب أن يبرز عمود الاغاروز على بعد بضعة ملليمترات من منطقة الجزء الشعري الذي يحتوي على الجنين.

لتركيب الجنين في غرفة العينة باستخدام نصف الكرة الأرضية الاغاروز ، اسحب أولا 200 ميكرولتر من الاغاروز السائل في حقنة ملليمتر واحد ، واستخدم المحقنة لملء الأنبوب الفولاذي بغرفة العينة مع الاغاروز من أعلى الأنبوب حتى يتشكل نصف الكرة الأرضية في الفتحة السفلية. عندما يتجمد Agarose ، التقط جنينا بطرف فرشاة الطلاء وأعد ترتيب الجنين بحيث يصبح الوصول إلى الطرف الأمامي. اغمس نصف الكرة الأرضية من الاغاروز في سائل الاغاروز لتغطية نصف الكرة الأرضية بغشاء رقيق ووضع الجنين مع نهايته الأمامية في وضع مستقيم على عمود نصف الكرة

اقلب الأنبوب الفولاذي واستخدم الفرشاة لتصحيح موضع الجنين حسب الضرورة. من الناحية المثالية ، يجب تغطية أقل من نصف سطح الجنين بالأغروز ويجب أن تكون الأجنحة شديدة الانحدار قدر الإمكان. يؤدي وجود الكثير من الاغاروز على سطح الجنين إلى انقباض ميكانيكي وانخفاض تبادل الغازات والأيونات ، مما له تأثير كبير على معدل بقاء الجنين.

ثم أدخل الأنبوب الفولاذي ببطء في غرفة العينة. لتركيب الجنين في غرفة العينة باستخدام حامل نسيج العنكبوت ، حدد أولا جنينا بفرشاة الطلاء واترك فرشاة الطلاء جانبا. بعد ذلك ، قم بتغطية الفتحة المشقوقة لحامل نسيج العنكبوت بخمسة إلى ثمانية ميكرولترات من الاغاروز السائل ، ثم قم بإزالة معظم الاغاروز حتى يتبقى طبقة رقيقة من الاغاروز فقط.

ضع الجنين على فيلم الاغاروز واضبط موضعه ، وحرك الجنين بعناية إلى مركز المحور السيني للثقب المشقوق ومحاذاة محوره الخلفي الأمامي الممدود مع المحور الممدود للثقب المشقوق تأكد من وضع الجنين على غشاء الاغاروز في غضون 10-15 ثانية بعد تطبيقه ، أي بينما لا يزال الاغاروز سائلا وإلا فلن يلتصق بشكل صحيح. ثم أدخل حامل نسيج العنكبوت ببطء في غرفة العينة ، مع وضع الحامل بحيث لا يتداخل مع ضوء الإثارة والانبعاث.

بالنسبة لمقايسات التصوير المباشر ، قم أولا بتكوين الفاصل الزمني ، ثم في وضع ضوء الإرسال ، ضع الجنين على طول المحور X و Y في مركز مجال الرؤية دون تعريض الجنين لليزر. قم بتدوير الجنين 360 درجة في خطوات 90 درجة لفحص الأنسجة بحثا عن أي ضرر يمكن أن يحدث أثناء عملية التركيب. في وضع الإزهار ، حدد Z-Stack لكل اتجاه ، مع إضافة مخزن مؤقت مكاني من 25 إلى 50 ميكرومتر أمام الجنين وخلفه وتحديد تباعد Z.

للتصوير طويل المدى ، تأكد من ملء غرفة العينة بمخزن تصوير كاف وتغطية فتحة غرفة العينة. ثم ابدأ عملية التصوير ، ومراقبة الاستحواذ الصحيح على طول جميع الاتجاهات في جميع القنوات لجميع الأجنة. في نهاية فترة التصوير ، قم بإزالة حامل العينة من غرفة العينة ونقل الجنين إلى شريحة كائن.

إذا تم استخدام عمود الاغاروز ، فاستخدم شفرة حادة لاستخراج الأجنة من الاغاروز المحيط. إذا تم استخدام نصف الكرة الأرضية الاغاروز ، فقم بنقل نصف الكرة الأرضية بجانب مسطح إلى شريحة الكائن. بالنسبة لطريقة حامل نسيج العنكبوت ، استخدم فرشاة طلاء لفك الجنين برفق من فيلم الاغاروز.

ثم احتضان الشريحة المحملة بالجنين في طبق زجاجي صغير في جو رطوبة مشبع في ظل الظروف القياسية حتى تفقس اليرقات. لمعالجة بيانات الجنين المرصود ، افتح الملفات ذات الأهمية في برنامج تحليل التصوير المناسب وقم بتدوير Z-Stacks لمحاذاة المحور الخلفي الأمامي للجنين مع المحور Y حسب الضرورة. قم بقص Z-Stacks على طول المحورين X وY بحيث تبقى خلفية صغيرة فقط ثم احسب الحد الأقصى للإسقاط Z لكل مكدس Z.

ثم اعتمادا على الخط المعدل وراثيا وطرق التصوير ، قم بإجراء تعديلات الكثافة الديناميكية المناسبة للمداخن الزمنية لتصحيح أي تبييض ضوئي أو نباتات لتقلبات التعبير حسب الضرورة. باستخدام خط معدل وراثيا يعبر عن بروتين اندماج هيستون 2B M-Emerald تحت سيطرة محفز ألفا توبوبلين ، تم تسجيل 66 ساعة من التطور الجنيني في درجة حرارة الغرفة من تراجع الشريط الجرثومي إلى الإغلاق الظهري. يمكن استخدام خط المصيدة المحسن هذا لتصور المجموعات العصبية داخل زوائد الرأس وديناميكيات هجرة الكبد أثناء الإغلاق الظهري.

تصوير خط معدل وراثيا مماثل يحمل نفس الجين المتصل ولكن في موقع جيني مختلف ، تظهر الأقسام البصرية للانتقال من المعدة إلى استطالة الشريط الجرثومي ترتيب الخلايا الداخلية للنطاق الجرثومي الناشئ. باستخدام الخط المعدل وراثيا الأزرق الدبقي ، يسمح الحصول على Z-Stacks على طول اتجاهات متعددة عبر دوران العينة بمراقبة إعادة تنظيم الخلايا الدبقية على طول وحول الحبل العصبي البطني بالإضافة إلى ديناميكيات تكاثرها للجانب الظهري من فصوص الرأس في نفس الجنين. يمكن أيضا استخدام الأصباغ الفلورية الصغيرة لوضع العلامات المحددة للهياكل بين الخلايا لتسليط الضوء على بعض السمات الجنينية مثل تليف الكبد ، أو خلايا تليف الكبد البطني الخلفي ، أو الطبقة الثلاثية ثلاثية الأنسجة الجرثومية السلوية المصلية التي تظهر أثناء إغلاق نافذة المصل.

يسمح تلطيخ صبغة الفلورسنت ثنائية اللون بمزيد من التصور لهيكلين بين الخلايا في نفس الجنين. على سبيل المثال الهيكل الخلوي الأكتين والغلاف النووي. بمجرد الانتهاء من التسجيل ، من المهم لمراقبة جودة التجربة استعادة الأجنة وتربيتها إلى بالغين أصحاء وخصوبين.

يمكن دمج هذا الإجراء مع تقنيات أخرى مثل اختلاف الحمض النووي الريبي الأبوي لتحليل الأنماط الظاهرية التي تم إسقاطها.