تسخير الحمض النووي صبغ أثار الجانب السكان النمط الظاهري للكشف عن وتنقية الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البيولوجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن مجموعات الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة في العينات البيولوجية بناءً على قدرة خلايا المجموعة الجانبية (side population) على طرد الصبغة. تعالج هذه الطريقة سؤالاً محورياً في أبحاث الخلايا الجذعية السرطانية يتعلق بالوسائل الموثوقة للكشف عن الخلايا الجذعية السرطانية وتنقيتها من العينات البيولوجية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تعتمد على علامات وظيفية، مما يوفر دقة فصل أفضل.

بالإضافة إلى ذلك، فإن تعبير ناقلات الأدوية ABC هذه محفوظ للغاية بين الخلايا الجذعية السرطانية، وبالتالي يمكننا استخدام هذه التقنية للعديد من الكيانات السرطانية المختلفة. وتمتد تداعيات هذه التقنية نحو اكتشاف علاجات مضادة للخلايا الجذعية السرطانية لأنها تسهل التحليلات اللاحقة مثل توصيف التعبير الجيني والتحقق من الأهداف في الخلايا السرطانية عالية النقاء. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول خصائص الخلايا الجذعية السرطانية.

يمكننا أيضاً استخدام هذه الطريقة لتوصيف الأنظمة التي تضم مجموعات تعبر عن ناقل العقاقير ABC، مثل نخاع العظم. ستقوم إليزابيث هوفلينر، وهي فنية من مختبري، باستعراض الإجراء. للبدء، يتم استنبات خط الخلايا السرطانية البشرية المطلوب عند 37 °C في 10 إلى 30 mL من وسط RPMI 1640 المكمل بـ 10% FBS، و 2 mM L-glutamine، ومضادات حيوية.

عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح تقريبًا بين 70 و90%، قم بإزالة الوسط وإضافة 2 mL من trypsin-EDTA بتركيز 0.05% لفصل الخلايا عن سطح طبق الزرع. بعد ذلك، اغسل الخلايا بـ 10 mL من وسط الزرع، وانقل المعلق إلى أنبوب نظيف سعة 15 mL، ثم قم بطرده بسرعة 250 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. وبمجرد تجميع الخلايا في شكل كرة (pellet)، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الكرة في 1 mL من وسط الزرع.

امزج كمية صغيرة من معلق الخلايا مع محلول صبغة تريبان الزرقاء (trypan blue) وقم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ولتحضير عينات الاختبار، علّق الخلايا في وسط استزراع جديد للحصول على معلق خلوي بتركيز 1×10⁶ خلية/مل. وبعد ضبط كثافة الخلايا، انقل 3 مل من العينة إلى أنبوب ذو قاع مستدير سعة 15 مل ومسمى "اختبار".

بعد ذلك، أضف 10 µM من الصبغة البنفسجية إلى العينة وقم برج المعلق برفق باستخدام جهاز vortex. بعد ذلك، قم بتحضير ضوابط التثبيط عن طريق نقل 500 µL من معلق الخلايا المحتوي على الصبغة إلى أنبوبي قياس التدفق الخلوي مُصنفين كـ "ضابط". أضف 50 µM من Verapamil إلى الأنبوب الأول.

أضف 20 µM من Fumitremorgin C إلى الأنبوب الثاني. اخلط المحاليل عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة. غطِ جميع الأنابيب بالأغطية واتركها في الحاضنة عند 37 °C في الظلام لمدة 90 دقيقة.

قم برج العينات برفق كل 15 دقيقة. وبمجرد اكتمال عملية التصبيغ، اغسل ضوابط التثبيط في ثلاثة إلى أربعة مليليترات من محلول PBS المبرد بالثلج. ثم قم بتحضير حصص من عينة الاختبار من أجل التصبيغ المشترك اللاحق باستخدام الأجسام المضادة.

اغسل هذه الأجزاء الموزعة أيضاً، ثم قم بترشيح جميع العينات باستخدام مصافٍ ذات فتحات بحجم 70 micron لإزالة تجمعات الخلايا المحتملة. بعد ذلك، قم بطرد المعلقات مركزياً عند 250 ×g في درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة خمس دقائق. وبعد إعادة تعليق الراسب الناتج في 100 µL من PBS، احتفظ بالخلايا على الثلج مع حمايتها من الضوء.

بعد ذلك، أضف مجموعة مناسبة من الأجسام المضادة المقترنة بالفلوركروم إلى الخلايا المصبوغة مسبقاً بالصبغة البنفسجية. قم برج المعلقات باستخدام جهاز الـ Vortex واحضنها عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة، اغسل الخلايا باستخدام 3 إلى 4 mL من محلول PBS المبرد بالثلج، وقم بترشيح العينة إذا لزم الأمر.

ثم يتم إجراء الطرد المركزي بقوة 250 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. تخلص من الطافي وأعد تعليق الخلايا المترسبة في 100 µL من PBS. وأخيرًا، أضف 7-AAD إلى الخلايا المصبوغة مسبقًا بالصبغة البنفسجية.

ثم يتم تحضين العينات لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في الظلام. ولتحليل الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي، يتم تحديد مجتمع خلوي مناسب عبر مخطط FSC SSC النقطي. بعد ذلك، وباستخدام إشارات FSC مختلفة، يتم استبعاد جميع التجمعات الخلوية من المجتمع المختار.

استبعد الخلايا التي تظهر صبغاً إيجابياً بـ 7-AAD للحصول على مجموعة الخلايا الحية. ولإنشاء مخطط نقطي لانبعاث الصبغة الزرقاء والحمراء، اعرض القناة الفلورية الزرقاء على المحور y والقناة الفلورية الحمراء على المحور x. قم بتحويل كلتا القناتين إلى الوضع الخطي واضبط جهد الكاشف وفقاً لذلك بحيث تقع المجموعة الجانبية في الجزء السفلي الأيسر من المخطط.

بعد ذلك، يتم تحديد مجموعة الخلايا الجانبية (side population). ثم يتم إيقاف عملية الاستحواذ. تالياً، يتم تحميل ضوابط التثبيط واستحواذ البيانات.

أخيرًا، قم بإنشاء مخطط نقطي (dot plot) يعرض التألق الأحمر للصبغة البنفسجية على المحور السيني (x-axis) وقناة تألق مناسبة على المحور الصادي (y-axis) مرسومة بالوضع اللوغاريتمي. قم بتحميل العينة ثم اضبط جهود الكاشف وفقًا لذلك وحدد جزء خلايا المجموعة الجانبية (side population cells) التي تعبر عن السطح المستهدف بالبحث. بعد ذلك، قم بتسجيل البيانات.

تُعرض هنا النتائج الممثلة لتحليل المجموعة الجانبية (side population) الذي أُجري على خلايا سرطان المبيض البشري. تم تحديد المجموعة الجانبية، التي ميزها تحليل الانبعاث الأزرق والبنفسجي المحمر، في الربع السفلي الأيسر من المخطط النقطي (dot plot)، وشكلت 0.70% من إجمالي المجموعة التي تم تحليلها. وأدى الاستخدام اللاحق لمثبطات التدفق (efflux inhibitors) إلى اختفاء إشارة الفلورة الملاحظة في الخلايا التي تم تحديدها سابقاً، مما يؤكد نمطها الظاهري كمجموعة جانبية.

أخيراً، تم توصيف الخلايا المبيضية البشرية من حيث تعبير ABCG2. وقد لوحظ وجود صبغ إيجابي لـ ABCG2 في 0.67% من الخلايا، وهو ما يتوافق مع المجموعة الجانبية المحددة. وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن تنفيذه في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريباً إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن النمط الظاهري للمجتمع الجانبي يعتمد بشكل صارم على النسبة المثالية لتركيز الصبغة إلى كثافة الخلايا. لذا، يوصى بشدة بمعايرة كلا المتغيرين قبل بدء التجربة. وعقب تنفيذ هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تحليل التعبير الجيني لمزيد من التوصيف لخلايا المجتمع الجانبي، وبالتالي تحديد أهداف جديدة خاصة بالخلايا الجذعية السرطانية لتطوير الأدوية في المستقبل.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية لاستكشاف خصائص الخلايا الجذعية النسيجية والخلايا الجذعية السرطانية، في كل من الفئران والبشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل المجموعة الجانبية SA المحفزة بالصبغة البنفسجية وكيفية الكشف عن الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة في العينات البيولوجية في مختبرك الخاص. لا تنسَ أن العمل مع العينات البيولوجية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب اتخاذ احتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية PPE وكبائن السلامة البيولوجية عند تنفيذ هذا الإجراء.