تسخير الحمض النووي صبغ أثار الجانب السكان النمط الظاهري للكشف عن وتنقية الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البيولوجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن مجموعات الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة في العينات البيولوجية بناء على قدرة بثق الصبغة للخلايا السكانية الجانبية. تتناول هذه الطريقة سؤالا رئيسيا في أبحاث الخلايا الجذعية السرطانية فيما يتعلق بالوسائل الموثوقة للكشف عن الخلايا الجذعية السرطانية وتنقيتها من العينات البيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنشر علامات وظيفية وبالتالي توفر دقة أفضل.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحفاظ على التعبير عن ناقلات الأدوية ABC بشكل كبير بين الخلايا الجذعية السرطانية ، وبالتالي يمكننا استخدام هذه التقنية للعديد من الكيانات السرطانية المختلفة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو اكتشاف علاجات الخلايا الجذعية المضادة للسرطان لأنها تسهل التحليل النهائي مثل توصيف التعبير الجيني والتحقق من صحة الهدف في الخلايا السرطانية عالية النقاء. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخصائص الخلايا الجذعية السرطانية.

يمكننا أيضا استخدام هذه الطريقة لتوصيفها على أنها أنظمة تشتمل على ناقل أدوية ABC يعبر عن مجموعات مثل نخاع العظام. ستظهر الإجراء إليزابيث هوفلينر ، فنية من مختبري. للبدء ، قم بزراعة خط الخلايا السرطانية البشرية المطلوب عند 37 درجة مئوية في 10 إلى 30 مل من وسط RPMI 1640 المكمل بنسبة 10٪ FBS ، واثنين من المليمترات L-glutamine ، والمضادات الحيوية.

عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 70 إلى 90٪ من التقاء ، قم بإزالة الوسط وأضف ملليلترين من 0.05٪ تريبسين-EDTA لفصل الخلايا عن سطح طبق الثقافة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ب 10 مل من وسط الاستزراع ، وانقل المعلق إلى أنبوب نظيف سعة 15 مليلتر ، وقم بتدويره عند 250 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بمجرد أن يتم تكوير الخلايا, تخلص من العليا وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط الثقافة.

امزج كمية صغيرة من تعليق الخلية مع محلول التريبان الأزرق واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. لإعداد عينات الاختبار ، قم بتعليق الخلايا في وسط ثقافة طازجة للحصول على تعليق خلية من مرة واحدة عشرة إلى الخلايا الست لكل مليلتر. بعد ضبط كثافة الخلية ، انقل ثلاثة ملليلتر من العينة إلى أنبوب سفلي دائري سعة 15 مليلتر يسمى اختبارا.

ثم أضف 10 ميكرومولار من صبغة البنفسج إلى العينة وقم بدوامة التعليق برفق. بعد ذلك ، قم بإعداد عناصر التحكم في التثبيط عن طريق نقل 500 ميكرولتر من الصبغة التي تحتوي على تعليق الخلية إلى أنبوبين لقياس التدفق الخلوي المسمى على أنهما تحكم. أضف 50 ميكرومولار من فيراباميل إلى الأول.

و 20 ميكرومولار من Fumitremorgin C إلى الأنبوب الثاني. واخلط المحاليل عن طريق سحب العينة برفق. قم بتغطية جميع الأنابيب بأغطية واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 90 دقيقة.

حرك العينات برفق كل 15 دقيقة. بمجرد اكتمال التلوين ، اغسل أدوات التحكم في التثبيط في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من PBS المثلج. وقم بإعداد حصص من عينة الاختبار للتزامن اللاحق مع الأجسام المضادة.

اغسل هذه الكميات أيضا وقم بتصفية جميع العينات من خلال مصافي مقطوعة 70 ميكرون لإزالة مجاميع الخلايا المحتملة. ثم قم بالطرد المركزي للتعليق عند 250 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد تعليق الحبيبات الناتجة في 100 ميكرولتر من PBS ، حافظ على الخلايا على الجليد محمية من الضوء.

بعد ذلك ، أضف لوحة مناسبة من الأجسام المضادة المترافقة فلوروكروم إلى الخلايا الملطخة بصبغة البنفسج. دوامة المعلقات واحتضانها عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من PBS المثلج ، وقم بتصفية العينة إذا رغبت في ذلك.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 250 ضعفا في G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطفية وأعد تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من PBS. أخيرا ، أضف 7-AAD إلى الخلايا الملطخة بصبغة البنفسج.

واحتضان العينات لمدة خمس إلى 10 دقائق في الظلام. لتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، قم ببوابة مجموعة خلايا مناسبة على مخطط نقطي FSC SSC. بعد ذلك ، باستخدام إشارات FSC مختلفة ، استبعد من المجموعة المحددة جميع مجاميع الخلايا.

استبعاد الخلايا التي تكشف عن تلطيخ إيجابي 7-AAD للحصول على عدد الخلايا القابلة للحياة. لإنشاء مخطط نقطي لانبعاث الصبغة الزرقاء والحمراء ، اعرض قناة الفلورسنت الزرقاء على المحور y وقناة الفلورسنت الحمراء على المحور x. قم بتبديل كلتا القناتين إلى الوضع الخطي واضبط جهد الكاشف وفقا لذلك بحيث يكون العدد الجانبي موجودا في الجزء الأيسر السفلي من المؤامرة.

ثم قم ببوابة السكان الجانبيين. ووقف الاستحواذ. بعد ذلك ، قم بتحميل عناصر التحكم في التثبيط والحصول على البيانات.

أخيرا ، قم بإنشاء مخطط نقطي يعرض الإزهار الأحمر للصبغة البنفسجية على المحور x وقناة الإزهار المناسبة على المحور y المرسومة في الوضع اللوغاريتمي. قم بتحميل العينة ثم اضبط جهد الكاشف وفقا لذلك وحدد فصيل الخلايا الجانبية التي تعبر عن السطح الذي تم فحصه. ثم قم بتسجيل البيانات.

فيما يلي نتائج تمثيلية لتحليل السكان الجانبيين الذي تم إجراؤه في خلايا سرطان المبيض البشرية. تم تحديد المجموعة الجانبية التي تميزت بتحليل الانبعاث الأزرق والأحمر البنفسجي في الربع السفلي الأيسر من المخطط النقطي وشكلت 0.70٪ من إجمالي السكان الذين تم تحليلهم. أدى الاستخدام اللاحق لمثبطات التدفق إلى اختفاء إشارة الإزهار التي لوحظت للخلايا المحددة مسبقا مما يؤكد نمطها الظاهري للسكان الجانبيين.

أخيرا ، تم تمييز خلايا المبيض البشرية أيضا من حيث تعبير ABCG2. لوحظ تلطيخ إيجابي ABCG2 في 0.67٪ من الخلايا المقابلة للمجموعة الجانبية المحددة. بمجرد إتقانه ، يمكن إجراء هذا الإجراء في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريبا إذا تم تنفيذه بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن النمط الظاهري للسكان الجانبيين يعتمد بشكل صارم على نسبة تركيز الصبغة إلى كثافة الخلية المثلى. لذلك يوصى بشدة بترطيب كلا المتغيرين قبل التجربة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل توصيف التعبير الجيني من أجل توصيف الخلايا السكانية الجانبية وبالتالي تحديد أهداف محددة للخلايا الجذعية السرطانية الجديدة لتطوير الأدوية في المستقبل.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية لاستكشاف خصائص الخلايا الجذعية للأنسجة والخلايا الجذعية السرطانية ، في كل من الفئران والرجال. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء صبغة البنفسج التي تسببت في SA وكيفية اكتشاف الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة في العينات البيولوجية في مختبرك. لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية وخزانات السلامة البيولوجية عند العمل مع هذا الإجراء.