في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

نمو الجريبات قبل الميضانية للفئران في المختبر تحت تأثير الجاذبية الصغرى المحاكات. يمكن تقسيم الإجراء بأكمله إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول، عزل الجريبات ميكانيكيًا من المبيضين باستخدام الإبر تحت المجهر المجسم.

الجزء الثاني، تغليف الجريب المفرد عن طريق نقله بالمصاصة إلى منتصف كل حبيبة ألجينات. الجزء الثالث، نقل حبيبات الألجينات التي تحتوي على الجريبات المفردة إلى قطرة وسط الزرع في نظام الزرع الدوار الذي يولد الجاذبية الصغرى المحاكية. الجزء الرابع، التقاط حبيبات الألجينات وتحرير الجريبات منها عن طريق التحضين في وسط مضاف إليه Alginate lyase لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة Centigrade.

عزل الجريبات وتغليفها. يتم جمع المبيضين في وسط مناولة، ثم يوضعان بعد ذلك في طبق آبار مركزي. وباستخدام المجهر المجسم، يتم عزل الجريبات من المبيضين بواسطة إبرتين.

احرص على عدم إتلاف الغشاء الوعائي. جهّز طبقاً يحتوي على قطرات من الوسط الغذائي وقم بتغطيته بالزيت. انقُل الجريبات إلى الطبق المُجهز.

اغسل الجريبات في الوسط الجديد ثم انقلها إلى قطرات الوسط. تحتوي كل قطرة من الوسط على جريبة واحدة. قم بتجهيز طبق زراعة مركزي وأضف محلول التغليف إلى الدائرة الخارجية.

قم بتحضير قارورة من محلول ألجينات بتركيز 0.8%. أضف 0.5 µL من محلول الألجينات في مركز الطبق. أضف قطرات من محلول الألجينات إلى محلول التغليف في الدائرة الخارجية من الطبق.

انقل الجريب إلى محلول alginate في مركز الطبق. اشطف الجريبات بمحلول alginate. انقل الجريبات إلى منتصف كل خرزة alginate عبر السطح الرخو للمحلول.

تحتوي كل خرزة ألجينات على جريب واحد. اشطف خرزات الألجينات بمحلول التغليف لتصلب الخرزات. انقل خرزات الألجينات إلى طبق جديد يحتوي على وسط المناولة.

استنبات الحويصلات المغلفة مختبرياً تحت تأثير محاكاة الجاذبية الصغرى. بالنسبة لمجموعة الضبط، أضف 150 milliliter من وسط الاستنبات إلى طبق جديد وغطِّه بالزيت. انقل ثلاث خرزات ألجينات إلى قطرة الوسط.

يتم تحضين الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لغرض الزرع. ولإجراء معالجة ببيئة تحاكي الجاذبية الصغرى، قم بتحضير طبق من الزيت، ثم انزع غطاء المنفذ، وأضف الزيت إلى الوعاء من خلال المنفذ المفتوح حتى يمتلئ الوعاء تقريباً. أضف 50 milliter من وسط الزرع إلى الزيت.

انقل ثلاث خرزات ألجينات إلى قطرة الوسط. أعد تركيب غطاء المنفذ المفتوح. يجب إزالة الفقاعات الهوائية الموجودة في الوعاء.

قم بإزالة غطاء منفذ المحقنة. ضع محقنتين تحتويان على الزيت في منفذ المحقنة. قم بتحريك الفقاعات الهوائية الموجودة أسفل منفذ المحقنة.

اسحب الفقاعات إلى المحقنة واحُقن نفس الحجم من الزيت من المحقنة الأخرى. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الوعاء. أغلق الصمامات، وأزل المحاقن، ثم أعد تركيب غطاء منفذ المحقنة.

لقد قمنا بالفعل بتجهيز أربعة أوعية تحتوي على حبيبات ألجينات. والآن حان الوقت لتثبيت الأوعية في القاعدة الدوارة. اضبط معدل الدوران حتى تصبح قطرة الوسط في حالة توازن.

انقل كلا الوعاءين والقاعدة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون من أجل الزرع. تغيير وسط الزرع. قم بإزالة غطاء الفتحة المفتوحة، واجمع حبيبات alginate والزيت في طبق جديد.

ابحث عن حبيبات alginate وانقلها إلى طبق يحتوي على الوسط المناول. أعد إنشاء نظام زراعة الأوعية كما في السابق. استعادة الجريبات.

قم بإزالة غطاء المنفذ المفتوح، واجمع خرزات الألجينات والزيت في طبق جديد. استخلص خرزات الألجينات والجريبات التي تمت إزالة غلافها من خرزات الألجينات عن طريق التحضين في وسط مناولة، مُدعم بإنزيم الألجينات لاييز (alginate lyase) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. النتائج. أظهر اختبار حيوية الخلايا أن الجريبات المفردة التي تمت زراعتها في ظروف الجاذبية الطبيعية تحتوي على عدد أكبر من الخلايا الحية وعدد أقل من الخلايا الميتة مقارنة بالجريبات التي تمت زراعتها في ظروف الجاذبية الصغرى المحاكات.

زاد حجم الجريب بشكل ملحوظ تحت كلتا حالتي الجاذبية. الخاتمة. توفر طريقتنا نموذجاً لدراسة الآليات المشاركة في عمليات التطور في المختبر للبويضة وخلايا الحبيبية تحت ظروف الجاذبية الصغرى المحاكية.