تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

الهدف من دراسة المستشعر الحيوي هذه هو مقارنة قدرة منصات الاستشعار الحيوي الأربعة المستخدمة بشكل روتيني على توفير بيانات حركية عالية الجودة وتقديم رؤى فيما يتعلق بالتحديات والاعتبارات التقنية في التصميمات التجريبية لتقييم تفاعلات الأجسام المضادة والمستضد عالية التقارب. تجيب هذه الدراسة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف الأدوية لاختيار منصات الاستشعار الحيوي وتنسيقات الفحص التي تسمح بالنتائج الأكثر موثوقية عند تقييم الأجسام المضادة العلاجية المرشحة. الميزة الرئيسية لهذه الدراسة هي أنها توفر مقارنة مباشرة وشاملة لمنصات أجهزة الاستشعار الحيوية المختلفة ، فيما يتعلق باتساق البيانات وجودتها وكفاءتها التشغيلية.

يعد العرض التوضيحي بالفيديو للبروتوكولات الأربعة أمرا بالغ الأهمية ، لأنه يساعد المستخدمين الجدد الذين لديهم خبرة عملية قليلة على تعلم كيفية إعداد التجارب على هذه الأدوات. بالنسبة للقياسات الحركية في Biacore T100، انقر فوق ملف، وفتح طريقة جديدة، وافتح ملف الأسلوب. راجع المعلمات في الطريقة.

في أنواع الدورات، اضبط وقت الاتصال على 220 ثانية للالتقاط 1 عبر مسار التدفق 2، و 110 ثانية للالتقاط 2 عبر مسار التدفق 3، و 55 ثانية للالتقاط 3 عبر مسار التدفق 4. معدل التدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة لجميع دورات الالتقاط. حدد نموذج 1 وتحقق من نموذج الحل كمتغير.

بعد ذلك، اضبط وقت الاتصال على 600 ثانية، ووقت التفكك على 2، 700 ثانية عبر مسار التدفق 1، 2، 3، 4. تم ضبط معدل التدفق على 30 ميكرولتر في الدقيقة. بعد ذلك ، حدد التجديد 1 ، وأدخل درجة الحموضة glycine HCl 1.5 في حقل المحلول ، واضبط وقت التلامس على 20 ثانية عبر مسار التدفق 1 ، 2 ، 3 ، 4.

في الإعدادات المتغيرة ، أدخل تركيزات معايرة مزدوجة من 100 نانومولار إلى 6.25 نانومولار للدورة 1-3 ، و 50 نانومولار إلى 3.12 نانومولار للدورة 4-8 ، و 5 نانومولار إلى 0.323 نانومولار للدورة 9-10. في تشغيل الإعداد، اختر مسار تدفق الكشف 2-1 و3-1 و4-1، ثم انقر فوق التالي. تحقق من prime قبل التشغيل ثم انقر فوق التالي مرة أخرى.

حدد نموذج ورف الكاشف 1 وحدد موقع الكواشف. ماصة الكواشف في قوارير العينة الفردية وفقا لذلك وأدخل الحامل في الأداة. انقر فوق Eject Rack لفتح باب حجرة علبة العينة ثم أدخل رف العينة في الجهاز.

ثم انقر فوق ابدأ وأدخل اسم التجربة ليتم حفظه لبدء التشغيل. بالنسبة للقياسات الحركية في ProteOn XPR36 ، ابدأ في الشلل عن طريق تحديد البروتوكولات ثم العينات. تعريف EDC / Sulfo-NHS كمنشط في الآبار H1-H6 ، والبروتين A / G كرابط في G1-G6 ، والإيثانول أمين كعامل تنشيط في F1-F6 ، والجلايسين كمجدد في E1-E6 ، و PBS-T-EDTA فارغ في D1-D6 ، وعينة الجسم المضاد أحادي النسيلة X على أنها رابط في C1-C6 ، و PCSK9 البشري كمادة تحليلية في الآبار B1-B6.

حدد الخطوات ثم انقر نقرا مزدوجا فوق الشلل في محرر البروتوكول. تشمل الخطوات ثلاث حقن أفقية لاحقة من EDC / Sulfo-NHS ، وبروتين A / G ، وإيثانول أمين مولي واحد. يجب أن يكون لكل حقنة معدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة ووقت تلامس 300 ثانية.

بعد ذلك ، انقر فوق إعادة إنشائ. حقن ثلاث نبضات من الجلايسين مدة كل منها 18 ثانية بسرعة 100 ميكرولتر في الدقيقة في كلا الاتجاهين الأفقي والرأسي. اتبع ذلك بنبضتين مدة كل منهما 60 ثانية من PBS-T-EDTA بمعدل 25 ميكرولتر في الدقيقة ، أيضا في كلا الاتجاهين.

ثم انقر فوق Ligand وحقن الجسم المضاد أحادي النسيلة 1 ، الجسم المضاد أحادي النسيلة 2 في الاتجاه الرأسي ، باستخدام معدل تدفق يبلغ 25 ميكرولتر في الدقيقة ووقت تلامس يبلغ 160 ثانية. بعد النقر فوق Analyte ، قم بحقن خمسة تركيزات من PCSK9 البشري في مخزن مؤقت فارغ عبر ست قنوات أفقية في وقت واحد. استخدم 40 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 600 ثانية من وقت الاقتران ، متبوعا ب 2،700 ثانية من وقت التفكك.

ثم انقر فوق تجديد وحقن نبضتين من الجلايسين مدة كل منهما 18 ثانية بسرعة 100 ميكرولتر في الدقيقة في كلا الاتجاهين الأفقي والرأسي. بعد ذلك ، قم بإعداد العينات والكواشف في صفيحة واحدة مكونة من 96 بئرا وفقا لمواضع الكاشف المحددة. انقل اللوحة إلى الأداة ثم انقر فوق علامة التبويب تشغيل ، وحدد البروتوكول ، وانقر فوق ابدأ.

يتم عرض الحقن المتوازي بست إبر في تسجيل البيانات التجريبية الحية. بالنسبة للقياسات الحركية في ثماني RED384 ، قم بإعداد الطريقة التجريبية بالنقر فوق التجربة أولا ، متبوعا بمعالج التجربة الجديدة ، وتجربة الحركية الجديدة ، ثم الحركية الأساسية في برنامج الحصول على البيانات. ثم انقر فوق تعديل الألواح وقم بتغيير 96 بئرا إلى 384 بئرا في كل من اللوحة 1 واللوحة 2.

حدد أنواع العينات والمواضع في اللوحة كما هو موضح في بروتوكول النص. انتقل إلى تعريف المقايسة لتحديد الإعداد التجريبي. يتم تعريف الإعداد التجريبي على أنه وقت أساسي يبلغ 30 ثانية ، ووقت تجديد 30 ثانية ، ووقت توازن 18 ثانية ، وتحميل بوقت 200 ثانية ، ووقت اقتران 500 ثانية ، ووقت تفكك يبلغ 1 ، 800 ثانية.

تم ضبط سرعة الاهتزاز على 1,000 دورة في الدقيقة. لإضافة الخطوات إلى قائمة خطوات الفحص ، انقر أولا فوق خطوة ، ثم انقر فوق الآبار الموجودة في العينة أو لوحة الكاشف. أولا ، أدخل تعليمات تجديد التوازن لتكييف مستشعرات التقاط Fc المضادة للإنسان مسبقا من خلال ثلاث دورات من الانخفاضات لمدة 15 ثانية في الجلايسين بالتناوب مع انخفاضات لمدة 15 ثانية في 1XKB.

بعد ذلك ، أدخل تعليمات التحميل لالتقاط عينات الأجسام المضادة أحادية النسيلة على مستشعرات التقاط Fc المضادة للإنسان لمدة 200 ثانية. بعد ذلك ، أدخل التعليمات الأساسية لإنشاء إشارة قياس تداخل الطبقة الحيوية لمدة 60 ثانية قبل خطوة الاقتران. أدخل خطوة الارتباط لغمس المستشعرات في الآبار التي تحتوي على تركيزات متفاوتة من PCSK9 البشري لفترة اقتران مدتها 500 ثانية.

أدخل خطوة التفكك لغمس المستشعرات المرتبطة ب PCSK9 في آبار جديدة من 1XKB لفترة تفكك مدتها 1 ، 800 ثانية. أخيرا ، بالنسبة لخطوة التجديد ، قم بغمس المستشعرات المرتبطة بالجسم المضاد أحادي النسيلة PCSK9 في آبار الجلايسين مع نبضتين مدة كل منهما 18 ثانية بين كل دورة ربط. انتقل إلى مراجعة التجارب، وقم بالتمرير عبر الخطوات، ثم انقر فوق الزر الأخضر لفتح حجرة العينة.

انقل لوحات العينة إلى الجهاز. انتقل إلى تشغيل التجارب، وأدخل وقت تأخير مدته 60 ثانية، وقم بهز لوحة العينة أثناء الانتظار. اضبط درجة حرارة اللوحة على 25 درجة مئوية ، وأدخل اسم تشغيل التجربة ، ثم اضغط على Go.Live يتم عرض جمع البيانات هنا.

للقياسات الحركية متعددة الدورات في IBIS-MX96 ، قم بتثبيت شريحة المستشعر في جهاز المراقبة الدقيقة للتدفق المستمر. افتح برنامج CFM2.0 ، ثم انقر فوق إعدادات التحميل ، و 96 Amine Couple. ضع لوحي العينة والكاشف في طابعة CFM.

لإنشاء مصفوفة الأجسام المضادة ، اضغط على تشغيل لبدء تشغيل الطابعة وتسليم EDC / Sulfo-NHS في النصف العلوي من لوحة الكاشف إلى المستشعر باستخدام 48 قناة دقيقة وتدويرها على سطح المستشعر لمدة خمس دقائق. قم بتسليم عينات الأجسام المضادة أحادية النسيلة في النصف العلوي من لوحة المصدر إلى المستشعر ، وقم بتدويرها عبر الأسطح المنشطة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتوصيل المخزن المؤقت للتثبيت من أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر فوق سطح الجسم المضاد لمدة خمس دقائق.

قم بإرساء شريحة المستشعر المطبوعة في الجهاز. في برنامج التحكم، انقر فوق ملف، وفتح القياس، والقياس الموجود، وحدد ملف الأسلوب. انقل شريحة المستشعر المطبوعة إلى الجهاز.

في القائمة العامة، حدد G-System Prime ضمن البرنامج النصي الكامل للنظام. بعد ذلك ، حدد G-Quench لإلغاء تنشيط أسطح الأجسام المضادة أحادية النسيلة عن طريق حقن 150 ميكرولتر من الإيثانول أمين المولاري. في دورة التحليل، حدد تشغيل A-AP Standard ضمن البرامج النصية IBIS.

اضبط 1.0 دقيقة لخط الأساس ، و 10.0 دقيقة للارتباط ، و 90 خطوة للتفكك بسرعة ثمانية ميكرولتر في الثانية. داخل الدورات ، قم بحقن PCSK9 البشري تركيزا واحدا في كل مرة ، بعد خمس حقن عازلة. تجديد أسطح الأجسام المضادة أحادية النسيلة بالجلايسين بين كل دورة ربط.

يتم عرض أجهزة استشعار الربط المسجلة في تراكبات ملاءمة النموذج الحركي الفردي للأجسام المضادة التي تتفاعل مع PCSK9 البشري في أربعة أدوات. تتشابه ملامح الربط للأجسام المضادة بكثافات متعددة عبر الأدوات. على الرغم من أن ثوابت المعدل المرتبطة بكل من الأجسام المضادة تختلف عبر الأدوات ، إلا أن ترتيب رتباتها ظلت كما هي في الغالب.

تم التحقيق في قابلية استنساخ واتساق الصلات في المعدلات الحركية على أسطح الأجسام المضادة المتعددة. كما هو موضح هنا ، لوحظت خطية قوية لجميع ثوابت المعدل التي تم إنشاؤها باستخدام Biacore T100 و ProteOn XPR36. ومع ذلك ، فإن ثوابت المعدل الناتجة عن Octet RED384 كانت أقل خطية بسبب التقلبات في بعض معدلات الإيقاف.

من المحتمل أن يكون هذا ناتجا عن تبخر العينة بمرور الوقت في الصفيحة الدقيقة. كانت ثوابت المعدل الناتجة عن IBIS-MX96 أقل خطية أيضا بسبب التقلبات في عدم تجانس السطح. كانت أنشطة ربط الأجسام المضادة المرتبطة بمعظم الأنظمة متسقة ، في حين لوحظ نشاط أقل بمقدار عشرة أضعاف تقريبا للطريقة المقترنة بالأمين من IBIS-MX96.

ربما كان هذا بسبب تعطيل الأجسام المضادة ، أو توليد اتجاهات الأجسام المضادة التي لم تكن موصلة لارتباط المستضد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد التجارب في كل من منصات المستشعرات الحيوية الأربعة ، وكيفية اختيار تقنية الاستشعار الحيوي المناسبة لغرض البحث الخاص بك. تظهر دراسة المقارنة المباشرة التي أجريناها أن كل منصة استشعار حيوي لها مزاياها وعيوبها.

على الرغم من بعض القيود المنهجية المتأصلة في الأجهزة ، كان الترتيب المباشر لكل من ثوابت معدل الارتباط والتفكك مرتبطا ارتباطا وثيقا بين هذه الأدوات. لغرض تصنيف المرشحين ، بافتراض أن عدد العينات وكمية المواد ليست عوامل مقيدة ، يمكن استخدام أي من هذه الأدوات ، لأنها يمكن أن تميز الأجسام المضادة بشكل مماثل ، بغض النظر عن أداة الاستيراد. هناك مفاضلة بين موثوقية البيانات ومعدل نقل العينة.

أظهر Biacore T100 ، متبوعا ب ProteOn XPR36R ، أفضل جودة واتساق للبيانات. في حين أن Octet RED384 و IBIS-MX96 يظهران مرونة عالية وإنتاجية مع تنازلات في دقة البيانات واتساقها. بالنسبة للدراسات التي تتطلب اكتشافا حساسا وموثوقا ، فإن Biacore T100 أو ProteOn XPR36 هو الأنسب.

بالنسبة للدراسات التي تكون فيها السرعة عاملا حاسما وهناك عدد كبير من العينات ، يفضل إما Octet Red384 أو IBIS-MX96. توفر الأدوات ذات السائل المستمر X بيانات عالية الجودة لحل التفاعلات ذات معدلات التفكك البطيئة. يتمثل القيد الرئيسي لأداة السوائل BRI في تبخر العينة بمرور الوقت في الصفيحة الدقيقة ، مما قد يؤدي إلى الانجراف التصاعدي ، مما يضر بدقة البيانات.