تقييم التعقيد الجذعي الحصين في الفئران المسنين باستخدام طريقة جولجي-كوكس

الهدف العام من هذه المنهجية هو صبغ أنسجة المخ بشكل صحيح من أجل فحص وتحديد مورفولوجيا التغصنات وتعقيدها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب. نظرا لأن تلطيخ جولجي يلطخ فقط مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا ، فيمكن استخدام هذه التقنية لتتبع بنية الخلايا العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تلطيخ أقسام الدماغ بسهولة دون التعرض لخطر جفافها أو سقوطها أثناء أي من خطوات الغسيل. سيوضح الإجراء فريد كيفر وتايلر ألكسندر وجولي أندرسون ، طلاب الدراسات العليا في مختبر الدكتور ألين. ابدأ بغمر نصف أدمغة القوارض التي تم حصادها حديثا وغير مثبتة في خمسة ملليلتر أو محلول قائم على كلوريد الزئبق.

نظرا لأن محلول كلوريد الزئبق حساس للضوء ، قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم. قم بتخزين العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، صب المحلول ببطء في حاوية مؤقتة قبل التخلص منه بشكل صحيح في حاوية نفايات بيولوجية.

أضف خمسة ملليلتر من محلول كلوريد الزئبق الطازج وتأكد من غمر العقول. أعد العينات إلى الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 13 يوما أخرى. بعد 14 يوما ، قم بإعداد مخزن مؤقت ما بعد التشريب عن طريق إضافة 30 جراما من محلول ما بعد التشريب الكهربائي إلى 90 مل من الماء المقطر أو منزوع الأيونات ، DH2O.

املأ كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار ب 6.5 مل من المخزن المؤقت بعد التشريب ، بئر واحد لكل دماغ. ثم قم بإزالة محلول كلوريد الزئبق من أنسجة المخ كما كان من قبل. اشطف المنديل باستخدام DH2O ، ثم انقل الأنسجة إلى الألواح المكونة من ستة آبار باستخدام عازلة ما بعد التشريب.

غطي الأطباق بورق الألمنيوم واحفظيها في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في اليوم التالي ، استنشق واستبدل المخزن المؤقت بعد التشريب. أعد تغطية الطبق واحفظه في ثلاجة أربع درجات مئوية.

قم بإعداد طبقتين أو ثلاث ألواح مكونة من 12 بئرا لكل دماغ عن طريق وضع العلامات أولا على الألواح الموجودة على أغطيتها بأرقام بترتيب تصاعدي من اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل. أضف رقم تعريف الدماغ المقطع. ماصة ملليلترين من 1X PBS في كل بئر من كل لوحة ، ثم قم بإعداد المسرح وتشغيل الاهتزاز.

ثم ضع شريطا على كتلة الأنسجة الخاصة بحامل العينة وأضف القليل من غراء cyanoacrylate في الأعلى. أخرج دماغا من الطبق المكون من ستة آبار وضعه على طبق بلاستيكي أو زجاجي. استخدم شفرة ذات حدين من الفولاذ المقاوم للصدأ لقطع المخيخ ذيليا ، مع التأكد من أن جزء المخيخ المتبقي على الدماغ مسطح.

ثم ضع السطح المسطح للمخيخ المتبقي على الغراء. بعد أن يجف الغراء ، ضع حامل العينة مع الأنسجة في حمام العينة. ضع حمام العينة على الاهتزاز وقم بتغطية عينة الأنسجة في PBS.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الشفرة بحامل شفرة الاهتزاز وقم بخفض الشفرة ببطء في حمام العينة حتى يتم غمرها بالكامل وأسفل الجزء العلوي من الأنسجة قليلا. بعد ذلك ، اضبط سرعة الاهتزاز على سبعة ، والسعة على ستة وزاوية القطع على 12 درجة. ابدأ الاهتزاز وقطع أقسام 200 ميكرون.

استخدم فرشاة طلاء كبيرة لنقل أقسام الأنسجة من حمام العينة إلى كل بئر مخصص من الألواح المكونة من 12 بئرا. استمر في قطع الأنسجة حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من أقسام الأنسجة. بعد التقسيم ، استخدم ماصة نقل لشفط PBS من آبار اللوحة المكونة من 12 بئرا ، ثم أضف ملليلترين من PBS-T واغسلها لمدة 30 دقيقة مع التحريض.

بالقرب من نهاية فترة الغسيل ، قم بتخفيف ثلاثة أجزاء من محلول هيدروكسيد الأمونيوم بخمسة أجزاء DH2O. ثم ، بعد إزالة PBS-T ، أضف محلول هيدروكسيد الأمونيوم المخفف. احميه من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم وصمة عار الأقسام لمدة 19 إلى 21 دقيقة.

ثم ، بعد إزالة محلول هيدروكسيد الأمونيوم بأمان ، أضف عازلة ما بعد التلوين. احميها بورق الألمنيوم والبقع لمدة 19 إلى 21 دقيقة أخرى. أخيرا ، اشطف الأقسام في PBS-T ثلاث مرات لمدة خمس إلى 10 دقائق في كل مرة.

قم بتركيب الأقسام على شرائح مغلفة بالجيلاتين بنسبة 1٪ باستخدام فرشاة الطلاء الكبيرة. اتركيها تجف لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم ضعيها في برطمان كوبلن واتركيها طوال الليل. قم بإزالة الشرائح من برطمان كوبلين وضعها في رف بلاستيكي في غطاء الدخان.

ضعها في طبق تلطيخ يحتوي على 100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق. قم بتجفيف الأقسام من خلال غسلتين أخريين لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشرائح في رف زجاجي واستخدم مقبضا معدنيا لخفض الرف في طبق تلطيخ زجاجي يحتوي على 99٪ زيلين.

اغسل الشرائح بتغييرين من الزيلين لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد انقضاء وقت الغسيل الثاني ، قم بإزالة الشرائح من الزيلين واحدة تلو الأخرى وقم بتغطية الأنسجة بسرعة بحوالي 0.25 مل من وسائط التثبيت. بعد ذلك ، خذ غطاء منزلق وضعه فوق الوسائط.

ادفع أي فقاعات هواء محاصرة أسفل أغطية الشرائح إلى الحافة بجسم غير حاد ، مثل نهاية فرشاة الطلاء. ضع الشرائح في منطقة بعيدة عن أشعة الشمس المباشرة واتركها تجف لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. بعد التجفيف ، انتقل إلى الحصول على الصور باستخدام المجهر والتحليل باستخدام البرنامج المناسب.

تظهر صورة المجال الساطع هذه خلية عصبية ملطخة بجولجي تفي بمعايير التصوير ومزيد من التحليل. يمكن رؤية جميع أنواع العمود الفقري الثلاثة بسهولة. التلوين متسق عبر طول التغصنات بالكامل ويتم عزل التغصنات عن الخلايا العصبية الأخرى.

يوضح هذا الشكل أن الخلايا العصبية الملطخة بجولجي داخل التلفيف المسنن أظهرت انخفاضا في الطول في الرتبتين الرابعة والسادسة بعد العلاج ب 5-fluorouracil مقارنة بالمجموعة المعالجة بالمحلول الملحي. يمكن استخدام تلطيخ جولجي للكشف عن الاختلافات الكبيرة في كثافة العمود الفقري. في التشعبات الهرمية القمية CA1 ، قلل إعطاء 5-فلورويوراسيل للفئران الحية بشكل كبير من كثافة العمود الفقري.

في التشعبات القاعدية ، لم تكن هناك تغييرات كبيرة في الكثافة الإجمالية للأشواك. كشف تحليل Sholl للتشعبات الهرمية القمية CA1 أن علاج 5-fluorouracil قلل بشكل كبير من الشجرة الشجيرية على مسافات تتراوح بين 40 إلى 160 ميكرون بعيدا عن سوما. في التشعبات القاعدية ، قلل علاج 5-fluorouracil من الشجرة المتغصنة على بعد 30 إلى 110 ميكرون بعيدا عن السوما.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية ، التي تمثل كل من عملية تلطيخ جولجي والتركيب والتنظيف والتغطية في غضون ثلاث ساعات لكل دماغ إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الروابط التشريحية العصبية في نموذج الفئران. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بالأقسام في محلول هيدروكسيد الأمونيوم لمدة 19 إلى 21 دقيقة فقط حتى لا تفرط في الخلايا العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تلطيخ أنسجة المخ وتقسيمها وشطفها بشكل صحيح. لا تنس أن العمل مع المحلول القائم على كلوريد الزئبق ومحلول هيدروكسيد الأمونيوم والزيلين يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا اتخذ الاحتياطات وارتد قفازات المختبر واعمل في غطاء الدخان عند تنفيذ هذا الإجراء.