ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو بدء عصبات جديدة ، وتمديدها بسرعة ، وربطها بدقة بالخلايا المستهدفة. هذا الإجراء ممكن فقط باستخدام الخلايا المزروعة في بيئة خاضعة للرقابة وقابلة للتكاثر. تسمح لنا هذه الطريقة بالإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب.

ما الذي يحد من معدل نمو الخلايا العصبية؟ ما مدى سرعة نموها؟ هل تلعب القرائن الميكانيكية دورا؟

يمكننا أيضا دراسة كيفية تكوين نقاط الاشتباك العصبي ، وكيف تجد الخلايا العصبية الخلية المستهدفة؟ كيف تتقدم نقاط الاشتباك العصبي في العمر وتنضج؟ وثالثا ، يمكننا البدء في بناء شبكات عصبية بشكل منهجي ، ودراسة كيفية حساب الخلايا العصبية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح سهولة التلاعب ، والاستنساخ التجريبي ، وفي النهاية درجة عالية من التحكم على مستوى الخلية الواحدة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتنظيف وإعداد العدد المطلوب من زلات الغطاء المعقمة. بعد ذلك ، قم بتغطية كل زلة غطاء ب 0.5 إلى 1 ملليلتر من 100 ميكروغرام لكل مليلتر PDL لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، اغسل الغطاء مرتين بالماء وقم بإزالة كل السائل. اتركها تجف في بيئة معقمة لمدة 5 إلى 10 دقائق أو حتى يجف السطح تماما. بعد ذلك ، ضع أجهزة الموائع الدقيقة بحيث تكون الأنماط متجهة لأعلى تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة الحيوية لمدة 10 دقائق.

بعد 10 دقائق ، ضع جهازا مائعا دقيقا بحيث يكون النمط متجها لأسفل ملامسا لزلة الغطاء النظيفة. استخدم الملقط للضغط برفق على الجهاز حتى يلتصق بالزجاج. لملء جهاز السكان الفردي بالوسط ، أضف 50 ميكرولترا من وسط الخلية الكامل إلى البئر العلوي الأيمن.

ثم أضف 50 ميكرولترا أخرى من وسط الخلية الكامل إلى قطر البئر إليها. لملء جهاز المجموعات السكانية المتعددة بالوسط ، أضف 30 ميكرولترا من NBM الكامل إلى صف واحد من الآبار. تأكد من تدفق الوسط بين الآبار.

ثم أضف 50 ميكرولترا من الوسط إلى كل بئر من الآبار المتبقية. ضع الأجهزة في طبق أكبر مع طبق مفتوح من الماء المعقم ، وضع الطبق في الحاضنة لمدة ساعة إلى ساعتين أثناء تحضير زراعة الخلايا. الآن ، قم بإزالة الوسط من الآبار العلوية لأجهزة الموائع الدقيقة دون إفراغ الآبار.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الخلية المركز في البئر العلوي الأيمن لجهاز الموائع الدقيقة ، وتحقق في المجهر من كيفية تدفق الخلايا داخل جهاز الموائع الدقيقة أحادي السكان. لصفيحة الخلايا في جهاز التجمعات المتعددة ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الخلية المركز في كل من الآبار العلوية. تحت المجهر ، تحقق مما إذا كانت الخلايا داخل الغرف.

بعد ذلك ، ضع الأجهزة في الحاضنة لمدة 15 إلى 30 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلية بالركيزة. بعد أن تلتصق الخلايا بالركيزة ، أضف 40 ميكرولترا من NBM إلى البئرين العلويين لجهاز السكان الفردي. سيساعد ذلك في إزالة فقاعات الهواء من القنوات الصغيرة.

أضف 20 ميكرولترا من MBM إلى الآبار العلوية لجهاز التجمعات المتعددة ، وهي نفس الآبار التي تم فيها حقن الخلايا. يجب أن تبرز الوسائط قليلا لتشكيل الغضروف المفصلي الإيجابي ، وإعطاء الآبار جانبا عليا للكعك. قبل يوم إلى يومين من إزالة جهاز الموائع الدقيقة ، أضف ملليلترين من NBM الدافئ مسبقا إلى كل طبق عينة وغمر الغرف.

ثم احتفظ بالأجهزة في الحاضنة. بعد ذلك ، استخدم ملاقط معقمة وطرف ماصة لإزالة أجهزة الموائع الدقيقة من زلات الغطاء تاركة تكوينا منقوشا من الخلايا العصبية. في هذا الإجراء ، و 40 إلى 60 ميكرولترا من الخرز المطلي ب PDL المحضر لثقافة الخلايا.

بعد ذلك ، أعد العينة إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة لتعزيز تكوين جهات الاتصال المتشابكة. بعد ذلك ، قم بتثبيت العينة في إعداد تجريبي بحيث يمكن تقييم الخلايا من الأعلى بواسطة ماصتين دقيقتين ، وكذلك الوصول إليها بصريا. في هذا التكوين ، توجد كاميرا CCD على المنفذ الجانبي للمجهر لالتقاط الصور.

قم بتوصيل كل ماصة مملوءة بالمحلول الملحي بحقنة سعة مليلتر واحد ، ثم قم بتنقيب العينة بمحلول ملحي فسيولوجي. بعد ذلك ، تحت المجهر ، تحقق من الفجوة بين مجموعتين عصبيتين معزولين للتأكد من أن المجموعتين غير متصلتين بشكل طبيعي. حدد حبة PDL غير متصلة بالخلايا العصبية في مجال الرؤية.

قم بمحاذاة الخرزة بطرف ماصة دقيقة من خلال التركيز على الخرزة ثم على الماصة الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتقريب الطرف قدر الإمكان من الخرزة عن طريق مراقبتها من خلال المجهر. بعد ذلك ، قم بالضغط السلبي على الماصة لالتقاط الخرزة ، والحفاظ على الضغط السلبي طوال التجربة.

الآن ، حدد حبة PDL متصلة بخلية عصبية في مجال الرؤية ، وقم بتوصيلها بالماصة الدقيقة الثانية باستخدام الشفط. اسحب مركب الخلايا العصبية PDL عن طريق تحريك جهاز المعالجة الدقيقة أو مرحلة العينة ببطء بسرعة 0.5 ميكرومتر في الدقيقة لمدة 1 ميكرومتر ، وتوقف مؤقتا لمدة خمس دقائق للسماح ببدء العصبة. اسحب مركب الخلايا العصبية PDL عن طريق تحريكه ببطء بشكل جانبي بسرعة 0.5 ميكرومتر في الدقيقة على ميكرومترين ، ثم توقف مؤقتا لمدة خمس دقائق للسماح باستطالة العصب.

بعد البدء الناجح وتمديد العصبية لأول خمسة ميكرومترات ، اسحب العصبية باستمرار بسرعة 20 ميكرومتر في الدقيقة. لتوصيل الخلايا العصبية ، حدد منطقة غنية بالعصبيات. استخدم حبات أخرى لقياس ارتفاع طرف الماصة فوق زلة الغطاء، وخفض مركب نيورويت حبة PDL بحيث يتصل جسديا بالخلايا العصبية.

اترك مركب نيورويت حبة PDL على اتصال مع العصبة المستهدفة أثناء التلاعب بالماصة الدقيقة الثانية. بعد ذلك ، قم بخفض الماصة الثانية مع حبة PDL الثانية فوق العصبة المشكلة حديثا على بعد حوالي 20 ميكرومتر من الخرزة الأولى ، واستخدم حبة PDL الثانية لدفع خيوط العصبية الجديدة نحو الخلية المستهدفة. بعد ذلك ، أمسك كلتا الخرزتين في مكانهما لمدة ساعة واحدة على الأقل.

تحقق من عدم وجود تورم بؤري ، سماكة الخلايا العصبية التي تلامس الخرزة ، باستخدام المجهر. خلال هذا الوقت ، قم بتغيير وسط العينة ببطء من محلول ملحي فسيولوجي إلى NBM متوازن بثاني أكسيد الكربون الدافئ مسبقا. حرر الخرزة من الماصة الثانية عن طريق تحرير الشفط.

إذا ظل العصبة الجديدة متصلة ، فحرر الخرزة الأولى أيضا. بعد ذلك ، ضع العينة بعناية مرة أخرى في الحاضنة لتقوية الاتصال العصبي للتجارب المستقبلية. يمكنك استخدام تسجيلات مشبك تصحيح الخلية بالكامل للتحقيق في الوظائف الكهربائية للاتصال الذي تم معالجته بشكل دقيق.

تظهر هنا مجموعات الخلايا العصبية المعزولة مفصولة بفجوة 100 ميكرومتر في أجهزة PDMS الدقيقة. تم إجراء تسجيلات المشبك الزوجية إلى التصحيح في تكوين الخلية الكاملة ، وتم تحليل الوصلات المستحثة ميكانيكيا ، ومقارنتها بتلك الموجودة في مجموعات الخلايا العصبية المتصلة بشكل طبيعي ، والسكان غير المتصلين. الاستجابات الكهربائية بعد إمكانات العمل قبل التشابك المسجلة من الخلايا العصبية المتصلة بشكل طبيعي وعن طريق التلاعب الدقيق أعلى بكثير وترتبط مؤقتا بنشاط ما قبل التشابك.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، وأثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن يكون لديك مزارع خلايا صحية وجيدة النمط على المدى الطويل لضمان نتائج سريعة وقابلة للتكرار. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق مختلفة للتحقق من الوظيفة الكهربائية للاتصال الذي تم التلاعب به بشكل دقيق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة مجموعات الخلايا في غرف الموائع الدقيقة ، واستخدام معالجات الماصة لبدء الخلايا العصبية وتوسيعها وتوصيلها.