خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الظهارية عن البربخ في الفئران وقياس الخصائص الكهربائية على هذه الخلايا المنفصلة بشكل أساسي باستخدام طريقة مشبك التصحيح للخلية بأكملها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التناسلية ، مثل وظيفة البربخ ، وهو أمر مهم لنضج المنوية ووراثة السمات الأبوية. تسمح هذه التقنية للمستخدم بكي الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية البربخية المعزولة بحيث يمكن بعد ذلك توضيح الوظيفة الفسيولوجية غير المعروفة لهذه الخلايا.

سيوضح الإجراء باو لي تشانغ ، طالب دراسات عليا من مختبري. لبدء الإجراء ، قم بتطهير أدوات التشريح عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول. ثم اتركها تجف في الهواء.

بعد ذلك ، قم بإعداد IMDM الكامل. بعد ذلك ، قم بإنشاء 50 مل من الكميات في ظروف معقمة ، وأغلقها باستخدام Parafilm ، واحفظها على أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول هضم إنزيم الكولاجينوس عن طريق إذابة الكولاجيناز من النوع الأول والكولاجيناز من النوع الثاني في RPMI ، مما ينتج عنه مليغرام واحد لكل مليلتر من كل كولاجيناز في المحلول.

قم بتصفية المحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر. ثم ضع علامة عليه كمحلول كولاجيناز ، واحتفظ بالمحلول في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. بعد ذلك ، اضبط حجم محلول الإنزيم بناء على وزن الإنزيم.

الحد الأدنى من الحجم المطلوب لكل من الذيل البربخي من فأر واحد هو ملليلتر. لتشريح ذيل الفئران البربخ ، ضحي بالحيوان إما باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم عن طريق حقن IP أو باستخدام غرفة الأيزوفلوران حتى لا يستجيب لتحفيز قرص الذيل ، متبوعا بخلع عنق الرحم. بعد ذلك ، قم بتطهير أسفل البطن عن طريق مسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ادفع الخصيتين برفق إلى أسفل البطن ثم افتح أسفل البطن بالقرب من كيس الصفن. بعد ذلك ، قم بإزالة الدهون البربخية وتشريح جميع الأعضاء التناسلية. بعد ذلك ، انقلها إلى الطبق باستخدام RPMI.

في محطة عمل نظيفة يتم التحكم فيها بتدفق الهواء ، قم بتشريح الذيل البربخي من الأنسجة الضامة والدهنية وكبسولة البربخ. ضع البربخ مع 0.2 مل من محلول الكولاجيناز في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. لفصل الخلايا المفردة عن الذيل البربخي ، قم بقطع البربخ في محلول الكولاجيناز باستخدام مقص ناعم حتى يصبح النسيج سائلا يشبه العجينة.

ثم اشطف المقص برفق مع باقي محلول الإنزيم في الأنبوب. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على خلاط حراري معدني لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بسرعة اهتزاز تبلغ 1،000 دورة في الدقيقة. ثم ، قم بالطرد المركزي لخليط أنسجة الإنزيم في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، صب المادة الطافية اللزجة التي تحتوي في الغالب على المنوية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من IMDM الكامل لإخماد كل النشاط الأنزيمي. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 49 مل من RPMI.

الطرد المركزي خليط الخلية وصب المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من IMDM الكامل مع التخلي اللطيف لمدة خمس دقائق على الأقل لفصل الخلايا المفردة عن خليط الأنسجة البربخية المعالجة الأنزيمية. افصل الخلايا الظهارية عن الخلايا الأخرى في ظل ظروف معقمة ، وزرع معلق الخلية على طبق بتري 10 سم يحتوي على IMDM كامل لمدة ثماني ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها في حاضنة عند 32 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، قم بإعداد زلات الغطاء المعقم عن طريق الغمر في الكحول بنسبة 100٪. جففها في الهواء ثم اغمسها في كمية صغيرة من وسط الاستزراع. بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء في أطباق استزراع بطول ستة سنتيمترات أو في آبار مفردة من صفيحة 24 بئرا.

الآن ، احصد الخلايا الظهارية المنفصلة عن طريق جمع معلق الخلية برفق من طبق بتري الذي يتكون في الغالب من الخلايا الظهارية. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 30 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ثم صب المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلترين من IMDM الكامل.

قم بزرع 0.2 مل من معلق الخلية المحصودة في وسط كل زلة غطاء معقمة. دع تعليق الخلية يستقر في قطرة السائل لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق بشكل فضفاض بزلات الغطاء الزجاجي. بعد ذلك ، أضف بعناية ملليلتر واحد من IMDM الكامل على حافة طبق طوله ستة سنتيمترات أو 0.3 مل من IMDM الكامل إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا ، دون إزعاج الخلايا.

احتفظ بالخلايا المفردة المعزولة على زلات الغطاء في الحاضنة عند 32 درجة مئوية حتى تجارب المشبك التصحيح. في يوم تجربة المشبك الرقعة ، قم بإذابة جزء واحد من المحلول داخل الخلايا على الجليد واحتفظ به باردا أثناء تجربة المشبك لمنع التدهور. بعد ذلك ، انقل الخلايا الظهارية المزروعة على زلة الغطاء الزجاجي إلى غرفة التسجيل المملوءة ب PSS القياسي في درجة حرارة الغرفة.

قم بتغيير PSS للاستحمام بعناية مرتين على الأقل باستخدام ماصة قبل أي تجارب لمشبك التصحيح. لإنشاء تكوين الخلية بأكملها، اغمر الماصة في محلول الحمام بأعلى سرعة للمعالج الدقيق. ابحث عن طرف الماصة على الشاشة المتصلة بالكاميرا الرقمية.

بعد ذلك ، قم بإبطاء سرعة المعالجة الدقيقة إلى الوضع المتوسط إلى العالي. تحقق بسرعة من مقاومة الماصة الدقيقة باستخدام الأمر واجهة الحصول على البيانات عن طريق تطبيق خطوة جهد تم إنشاؤها من مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر. قم بالتغيير إلى ماصة دقيقة جديدة إذا كانت المقاومة خارج هذا النطاق بشكل كبير.

واضبط جهد تقاطع السائل بين الماصة ومحلول الحمام على الصفر باستخدام أمر إزاحة الماصة في واجهة القائد للبرنامج. راقب المقاومة باختبار الغشاء. إذا كانت المقاومة أكبر من 500 ميجاأوم ، ولكنها أصغر من جيجا أوم واحد ، فقم بتطبيق جهد سلبي للمساعدة في تكوين الجيجاأوم.

في غضون ذلك ، قم بتعويض التيار السعوي العابر للماصة الدقيقة. في هذه اللحظة ، قم بتطبيق خطوة فرط الاستقطاب 10 مللي فولت من إمكانية الاحتفاظ بصفر مللي فولت لتحديد مقاومة الختم. مباشرة بعد تحقيق تكوين ناجح للخلية الكاملة ، قم بتطبيق خطوة فرط الاستقطاب 10 مللي فولت من جهد الاحتفاظ سالب 60 مللي فولت.

قم بتبديل وضع الجهد إلى وضع التيار الصفري وقم بإجراء تسجيل خال من الفجوات لمدة 10 ثوان لقياس إمكانات غشاء الراحة للخلية. بعد ذلك ، عد بسرعة إلى وضع الجهد وابق فيه. تطبيق بروتوكولات الجهد وفقا للتجارب المخطط لها وقياس الاستجابات الحالية.

فيما يلي أمثلة على الخلايا الظهارية المعزولة من ذيل الفئران البريديميديس قبل وبعد إعادة حصاد الثقافة الليلية على الطبق قبل تجارب المشبك التصحيحي. يوضح هذا الشكل التيارات النموذجية للخلية الكاملة المسجلة من الخلايا الظهارية البربخية المفردة باستخدام بروتوكول استنباط النبض. يشير الخط المنقط إلى مستويات التيار الصفرية.

فيما يلي علاقة الجهد الحالي للاستجابات الحالية المقاسة في النقاط الزمنية المشار إليها. هذه هي التتبع التمثيلي لإمكانات غشاء الراحة للخلايا الرئيسية التي تم تحللها بمحلول ماصة ، إما باستخدام ATP أو بدون ATP. ولا يظهر هذا الرسم البياني الشريطي فرقا معنويا بين إمكانات غشاء الراحة الأولية لزائد ATP وناقص ATP.

الأرقام الموجودة بين قوسين داخل الأشرطة إلى عدد الخلايا المختبرة من ثلاثة على الأقل. وفيما يلي تحليلات الارتباط لمقاومة الختم ومقاومة المدخلات لجميع الخلايا ، أو الخلايا الرئيسية فقط مقابل إمكانات الراحة المقاسة عند مشبك التيار الصفري بعد فترة وجيزة من إنشاء الخلية بأكملها والمقادير الحالية المقاسة عند خطوة فرط الاستقطاب إلى سالب 100 مللي فولت من الاحتفاظ بالإمكانات. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في تسع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إيقاف الهضم الأنزيمي على الفور أثناء خطوات عزل الخلايا. خلاف ذلك ، قد يحدث فرط الهضم مما قد يؤدي إلى صعوبة تكوين ختم جيجا أوم وفشل تجارب المشبك التصحيح. للحفاظ على صحة الثقافة ، من المهم تدوير خليط الخلايا المنفصلة إنزيميا بسرعة منخفضة تبلغ 30 جم لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، ثم صب المادة الطافية اللزجة التي تحتوي في الغالب على خلايا المنوية.

باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الخلايا الحية وتقنيات زراعة الخلية الواحدة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل إمكانات الغشاء المريح في الخلايا الظهارية الساذجة التي قد تنظم السلوك خارج الخلية في ظل ظروف خاضعة للرقابة. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التناسلية لاستكشاف الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا الظهارية للبربخ لتنظيم نضوج المنوية ووراثة السمات المكتسبة من الأب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الظهارية عن البربخ في الفئران وكيفية قياس الخصائص الكهربائية على هذه الخلايا باستخدام طريقة مشبك التصحيح للخلية بأكملها.