حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير وزراعة ومعالجة وإجراء التلوين المناعي لمستنبتات القوقعة الجنينية للفئران حديثة الولادة لاستخدامها كأداة فحص في المختبر (in vitro) في أبحاث السمع. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث السمع، مثل تمكين الدراسة المتزامنة للخلايا الشعرية القوقعية، والمشابك العصبية، والزوائد العصبية، والعصبونات في نموذج خارج الجسم (ex vivo)، وتوفير رؤية أعمق لآليات عمل الجزيئات الجديدة في القوقعة، بما في ذلك العوامل الموجودة في الإفرازات البشرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تسريع عملية فحص المركبات العلاجية المرشحة قبل اختبارها داخل الجسم (in vivo).

ابدأ برأس حديث الولادة تم جمعه حديثاً وهو محفوظ في ethanol بنسبة 70% في غطاء طبق بتري. استخدم شفرة مشرط لإجراء قطع سطحي في الجلد من الطرف الأمامي إلى الطرف الخلفي للجمجمة. بعد ذلك، قم بقطع القناتين السمعيتين الخارجيتين واطوِ الجلد نحو الأمام للكشف عن كامل القحف.

بعد ذلك، يتم فتح القحف على طول الدرز السهمي عن طريق تحريك شفرة المشرط بلطف للأعلى والأسفل من الجهة الأمامية إلى الخلفية لتجنب الضغط على القوقعة. يتم إزالة وتخلص من الخطم عن طريق إجراء قطع عمودي مباشرة خلف الحجاجين. يجب أن يظل الجزء الخلفي من الجمجمة محتوياً على الدماغ والقوقعة.

بعد ذلك، استخدم ملقطاً لتشريح الدماغ الأمامي والمخيخ وجذع الدماغ بشكل غير حاد والتخلص منها. ضع نصفي الجمجمة في طبق بتري بلاستيكي بقطر 60 ملم مملوء بمحلول HBSS البارد. ثم استخدم الملقط لكشف القوقعة بالكامل، وهي مجاورة للشريان الركابي المحيط بها، وافصل العضو عن العظم الصدغي بشكل غير حاد.

انقل القوقعة إلى طبق بتري بقاع زجاجي وجدران شفافة سعة 50 millimeter يحتوي على HBSS، وضع الطبق تحت المجهر. ضع طبق بتري البلاستيكي سعة 60 millimeter الذي يحتوي على النصف الآخر من الجمجمة على الثلج. بعد ذلك، استخدم 4 ملاقط لتشريح المحفظة العظمية للقوقعة بعناية.

الآن، استخدم سكيناً دقيقاً أو ملقطين من نوع 55 لفصل الرباط الحلزوني الملتصق بعضوة كورتي بعناية عن بقية القوقعة والجانب الإنسي. يمكن القيام بذلك عن طريق الإمساك بالرباط الحلزوني من جانبه القاعدي الأكثر انخفاضاً وفكه بلطف أثناء التحرك باتجاه القمة. بعد إزالة الرباط الحلزوني، قم بوضع العينة للحصول على عرض سهمي طولي للقوقعة.

بعد ذلك، يتم قطع القوقعة إلى قسمين أو ثلاثة أقسام باستخدام السكين الدقيق، مع تصنيف هذه الأقسام إلى لفات قمية ولفات قاعدية. قم بإزالة الأنسجة العلوية من القطعة القمية والأنسجة السفلية من القطعة القاعدية، وصولاً إلى الطبقة الفعلية للخلايا الشعرية والمحاوير العصبية للسماح للمستنبت القوقعي بالاستقرار أفقياً في طبق بتري. بعد ذلك، استخدم الملقط للإمساك بلطف بالغشاء السمعي وإزالته، وهو طبقة شفافة رقيقة جداً تقع مباشرة فوق عضو كورتي.

تعتبر خطوة إزالة الغشاء السقفي الرقيق والشفاف هي الأكثر تحدياً من الناحية التقنية، حيث يمكن بسهولة إتلاف الخلايا الشعرية الموجودة أسفله. ومن خلال البدء من حواف النسيج، يتم الحفاظ على الخلايا الشعرية على طول المستنبت النسيجي، باستثناء الحافة القصوى التي بدأت منها عملية تقشير الغشاء السقفي. وأخيراً، قم بإزالة غشاء ريسنر الموجود مباشرة فوق عصبونات العقدة الحلزونية عن طريق لمسه بالملقط من كلا الجانبين وتقشيره بعيداً.

أصبحت عينة القوقعة الآن جاهزة للزراعة بعد إزالة أي مناطق تالفة من الحواف. ابدأ إجراء الزراعة بترطيب طرف ماصة سعة 1 مل بحوالي 120 µL من DMEM لمنع التصاق المستنبت بجدار الماصة من الداخل. ثم استخدم الطرف المرطب لسحب ما لا يزيد عن 70 µL من طبق بتري ذو القاعدة الزجاجية، وضع العينة مع السائل في أحد الفجوات الأربع في طبق بتري ذو الأربع فجوات.

تحقق تحت المجهر من أن المستأصل في الاتجاه الصحيح. تأكد من أن منطقة الخلايا الشعرية التي أُزيل منها الغشاء السقفي موجهة للأعلى، وأن الغشاء القاعدي مع الجزء القاعدي المقصوص من الجانب الإنسي موجه للأسفل وملتصق بقطعة الغطاء الزجاجي. إذا تبين عند الفحص أن العينة موجهة بشكل مقلوب، كما هو موضح هنا، أضف محلول HBSS من طرف الماصة وأعد وضع القطعة حتى تصبح في الاتجاه الصحيح.

بمجرد توجيه المستأصل بشكل صحيح، قم بشفط فائض محلول HBSS ثم انتظر لمدة 15 ثانية. الآن، انقل بواسطة الماصة 60 µL من وسط استزراع دافئ مباشرة فوق العينة، مع الحرص على عدم لمس العينة بالماصة. أعد أغطية أطباق بيتري الداخلية والخارجية واحفظها في الحاضنة طوال الليل عند 37 °C.

في اليوم التالي، انقل أطباق بتري التي تحتوي على مستنبتات القوقعة من الحاضنة إلى غطاء التدفق الصفائحي. اشفط وسط الزرع القديم الخالي من FBS من الغلاف الداخلي. أضف 60 µL لكل بئر من وسط المعالجة الدافئ المُحضّر.

أعد طبق بتري إلى الحاضنة حتى يتم صبغ المزارع بعد فترة أقصاها سبعة أيام. وكما يظهر في هذه الصورة المجهرية البؤرية، تحافظ هذه التقنية على تشريح الدورة القوقعية بأكملها، بما في ذلك عصبونات العقدة الحلزونية أو SGNs، مما يسمح بتحليل آثار العلاج على الاستطالات العصبية والأجسام الخلوية لـ SGNs بالإضافة إلى عضو كورتي. وكما يتضح هنا، يمكن استخدام هذه المستنبتات لمقارنة تأثير العلاج على الدورتين القمية والقاعدية في آن واحد بعد الصبغ المناعي الفلوري.

تظهر الخلايا الشعرية باللون الأخضر، بينما تظهر البنى العصبية باللون الأحمر. ويمكن تقييم المشابك العصبية السليمة من خلال وسم البروتينات قبل المشبكية الموضحة باللون الأحمر والبروتينات بعد المشبكية الموضحة باللون الأخضر، بالتزامن مع صبغ البنى العصبية باللون الأزرق. يوضح هذا الشكل صوراً تمثيلية لمستنبتات القوقعة القمية والقاعدية بعد سبعة أيام من الزراعة، إما مع 3%FBS على اليسار أو 1%FBS على اليمين.

تبدأ الخلايا المحضنة في 3%FBS بالهجرة بين اليومين الرابع والخامس، كما توضح الأسهم الرمادية الفاتحة للخلايا الشعرية والأسهم الحمراء للزوائد العصبية. وتحافظ المستزرعات النسيجية في 1%FBS على سلامتها التنظيمية حتى اليوم السابع. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق بصرياً من السلامة الهيكلية وتوجيه نسيج القوقعة قبل إضافة أوساط الزراعة النهائية والمواد المراد دراستها.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لتأكيد التموضع النوعي للخلايا التي تعبر عن GFP داخل النواة الإنسية (medialis).