عزل السكان الجانب في الخلايا التائية التي يسببها ميك الخلايا اللمفاوية الحادة اللمفاوية في الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا المجموعة الجانبية (side population) من نموذج سمكة الزيبرا المصابة بسرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية المستحث بواسطة جين myc. وقد استُخدم اختبار المجموعة الجانبية لتحديد مجموعات الخلايا الجذعية والخلايا السلفية في العديد من الأنسجة الطبيعية والسرطانية، إلا أنه لم يتم تطبيقه بعد على أي من نماذج السرطان في سمكة الزيبرا.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح العزل الاستباقي لمجموعة من الخلايا في سرطان الدم الليمفاوي الحاد من نوع T (T-ALL) في سمكة الزيبرا، والتي قد تكون غنية بنشاط الخلايا الجذعية السرطانية. ورغم أن الطريقة التي نصفها هنا لها تطبيقات واسعة في أبحاث سرطان الدم لدى سمكة الزيبرا، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من خلايا سمكة الزيبرا، سواء كانت خبيثة أو غير خبيثة. وقد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً لحساسيتها للتغيرات الطفيفة.

على الرغم من أن الطريقة تبدو مباشرة، إلا أن التحسين مطلوب لكل نوع من الخلايا التي يتم اختبارها. قم بتحضير 20 milliliters من 10 percent من FBS المثبط حرارياً في 0.9x PBS. أضف one milliliter من محلول FBS/PBS إلى قارورة من ملح الصوديوم للهيبارين تحتوي على 300 units من مضاد التخثر.

بعد ذلك، وباستخدام مجهر إبيفلوريسنت (epifluorescent microscope)، اختر الأسماك التي غزت الخلايا الورمية 50% من جسمها، أو الأسماك التي يتبين أنها تعاني من صعوبة في الأكل أو السباحة. قم بقتل الأسماك رحمةً عن طريق نقلها إلى محلول يحتوي على 1 إلى 2 mg/mL من مادة التريكاين (tricaine) في ماء الأسماك. راقب الحيوان للتأكد من توقف حركة الخياشيم ونبض القلب لتأكيد إتمام عملية القتل الرحيم.

بعد إزالة رأس السمكة، يتم حقن 100 µL من محلول الهيبارين في تجويف الجسم باستخدام الماصة لإزالة خلايا الدم الحمراء الزائدة. يتم سحب جميع السوائل المنسكبة ونقلها بواسطة الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. بعد ذلك، وباستخدام رؤوس ماصات جديدة، يتم غسل تجويف الجسم مرتين إضافيتين أو حتى يصبح محلول الغسيل خالياً من أي دم، مع التخلص من السوائل التي تم جمعها من جميع عمليات الغسل.

لجمع خلايا اللوكيميا، احقن 100 µL من محلول FBS/PBS في تجويف الجسم المغسول مسبقاً. وباستخدام مجهر تشريحي، طبق ضغطاً خفيفاً على جسم السمكة باستخدام طرف ماصة لإخراج الخلايا الورمية. اجمع السائل المنطلق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.

كرر عملية العزل حتى يتم جمع معظم الخلايا الورمية. اجمع كافة الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter واحد، واحفظ المعلق الناتج في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، امزج الخلايا الورمية المعزولة عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة لتفكيك تجمعات الخلايا.

قم بترشيح معلق الخلايا عبر مرشح شبكي بمسام 40 ميكرومتر. واغسل المرشح من مرة إلى مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من FBS/PBS. وبمجرد الانتهاء من الترشيح، احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة.

وأخيراً، في أنبوب جديد، اخلط 2 µL من معلق الخلايا مع 18 µL من محلول Trypan Blue المعقم بتركيز 0.04%. ضع 10 µL من المعلق الناتج في مقياس كرات الدم (hemocytometer) وقم بتعداد الخلايا الورمية الفلورية الحيوية. ومن المهم جمع عينة نقية من خلايا T-ALL.

يعتمد تركيز Hoechst 33342 المستخدم هنا على عدد الخلايا الورمية الحية التي تم جمعها. قد تتداخل الحطام الخلوي الإضافي أو الخلايا غير الورمية مع المقايسة. قبل صبغ الخلايا، قم بتخفيف صبغة Hoechst في ماء خالٍ من النوكلياز للحصول على محلول عمل بتركيز 1 mg/mL.

يُحفظ المحلول المُحضّر مغطىً بورق الألمنيوم عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم إذابة 49.1 mg من verapamil في 1 mL من DMSO للحصول على محلول مثبط بتركيز 100 µM. تالياً، يتم تحضير العينة بإضافة FBS/PBS، و 2.5 µL من DMSO، و 15 µL من صبغة Hoechst بتركيز 1 mg/mL، و 10⁶ من الخلايا الورمية إلى أنبوب fax بحيث يكون الحجم النهائي 1 mL.

لتحضير العينة الضابطة، وبإضافة FBS/PBS، و2.5 µL من verapamil بتركيز 100 mM، و15 µL من صبغة Hoechst بتركيز 1 mg/mL، أضف 10⁶ من الخلايا الورمية ليصل الحجم النهائي إلى 1 mL. قم بحضن العينة والعينة الضابطة في حمام مائي بدرجة حرارة 28 °C في الظلام لمدة 120 دقيقة. بعد الحضن، ضع الخلايا فوراً على الثلج واحفظها في الظلام.

قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 ×g في درجة حرارة 4 °C لمدة ست دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي واغسل الخلايا باستخدام 1 mL من FBS/PBS. قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى عند 300 ×g في درجة حرارة 4 °C لمدة ست دقائق.

بمجرد تجميع الخلايا في شكل كريات، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 1 mL من FBS/PBS. احفظ العينات عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم فرز الخلايا. قبل 15 دقيقة من فرز الخلايا، أضف 2 µL من المحلول المخزون لصبغة propidium iodine بتركيز 1 mg/mL لكل 1 mL من معلق الخلايا.

بعد ذلك، قم برج العينات جيداً باستخدام جهاز مزج العينات (vortex). قم بتحليل معلقات خلايا T-ALL المصبوغة من سمك الزيبرا باستخدام جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة. قم باستثارة العينات باستخدام ليزر UV لتحليل صبغة Hoechst، وليزر بطول موجي 488 nanometer للكشف عن خلايا T-ALL الموجبة لصبغة propidium iodide أو GFP.

قد يتطلب الأمر تحسين عدد الخلايا، وتركيز الصبغة، ودرجة حرارة التحضين، ومدة التحضين لكل نوع خلوي مختلف مستخدم. ويمكن للتغييرات في أي من هذه الظروف أن تغير نتائج المقايسة بشكل جذري. ولتحديد المجموعة الجانبية (side population) من بين خلايا T-ALL المعزولة من أسماك الزيبرا، يتم أولاً استبعاد الحطام الخلوي والتجمعات الخلوية.

يتم بعد ذلك تحليل امتصاص يوديد البروبيديوم وتعبير GFP في مجموعة خلوية واحدة لتحديد الخلايا الورمية الحية. ولتصوير المجموعة الجانبية، يتمت مقارنة الانبعاثات الزرقاء والحمراء لصبغة Hoechst. تظهر المجموعة الجانبية كذيل باهت من الخلايا يمتد من الجانب الأيسر للمجموعة الخلوية الرئيسية باتجاه محور الفلورية الزرقاء.

تُعرض هنا نتائج تحليل المجموعات الجانبية (side population analysis) الذي أُجري على عينتين مختلفتين من الخلايا الورمية. وقد تم تحديد مجموعة جانبية في كلتا العينتين، ومع ذلك، احتوت عينات الأورام المختلفة على أعداد متفاوتة من خلايا المجموعات الجانبية.

وبغض النظر عن عينة الورم التي تم تحليلها، أدى معالجة العينة بمثبط التدفق فيراباميل (verapamil) إلى اختفاء الإشارة الملحوظة في الخلايا التي تم تحديدها مسبقاً، مما يؤكد بشكل أكبر النمط الظاهري للمجموعات الجانبية. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ تقنية المجموعة الجانبية على سرطان خلايا T الحاد (T-ALL) في سمكة الزيبرا في أقل من أربع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح وكما عرضنا هنا. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الخطوات التي تم تحسينها لسرطان خلايا T الحاد في سمكة الزيبرا، مثل درجة حرارة ووقت الحضانة، وتركيز الصبغة، ومثبط التدفق.

قد يلزم تغيير هذه المعايير لأنظمة تجريبية مختلفة. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل عزل RNA، أو مقاييس الزرع في الجسم الحي (in vivo)، باستخدام خلايا المجتمع الجانبي (side population) التي تم فرزها، وذلك للإجابة على الأسئلة المتعلقة بالوظائف والتنظيم الجيني لخلايا المجتمع الجانبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل المجتمع الجانبي من الخلايا من سرطان الدم الليمفاوي الحاد في الخلايا التائية لدى سمك الزيبرا.