Name: تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: تعلم عزل وزراعة الأجزاء الكلوية الأولية من أجنة الفئران لدراسة تفرع القنوات البولية. هذه الطريقة البسيطة تساعد الباحثين على فهم تكوين الكلى والتشوهات الخلقية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويشكر المؤلفان ليف أوكسبرغ وديريك آدمز على مشاركتهما بسخاء في معرفتهما، ليف أوكسبرغ على تعليقاتهما المفيدة على المخطوطة، وستيفان وولفل وأولريكي مولر على دعمهما التقني وساسكيا شميتكرت وجوليا غوبرت وساشا وير وفيولا ماير للمساعدة في مختبر. وأيد هذا العمل من قبل التنمية، شركة علماء الأحياء (ل كب).

وتم الحفاظ على الفئران وفقا للوائح السويدية وتشريعات الاتحاد الأوروبي (2010/63 / يو). وتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات السويدية (التصاريح C79 / 9 و C248 / 11 و C135 / 14). وقد تمت الموافقة على الإجراءات في جامعة هايدلبرغ التي تتعلق بالمواضيع الحيوانية من قبل ريجيرونسبراسيديوم كارلسروه وضباط رعاية الحيوان في جامعة هايدلبرغ. 1. إعداد الكواشف والمواد للثقافة ملاحظة: استخدام غطاء تدفق رقائقي للحد من التلوث. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم تشريح، قبل الكتلة البشرية فك وحدها أو المؤتلف البروتين إفرين خيالي تنصهر إلى فك البشري عن طريق مزجها مع الأجسام المضادة الماعز فك الإنسان بنسبة مولارية من 1: 5 في المالحة الفوسفات معقمة المالحة (بس). احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية 5 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسط الثقافة عن طريق استكمال دولبيكو في النسر المعدل المتوسطة: المغذياتالخليط F-12 (دمم / F12) مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (v / v)، 1٪ الجلوتامين (الخامس / الخامس)، 1٪ الأنسولين ترانسفرين-السيلينيوم (v / v)، 50 ميكروغرام / مل الإنسان holo- ترانسفيرين، و 1.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين. ملاحظة: 10 مل من المتوسط ​​يكفي ل 16 الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول إفرين متجمد المؤتلف في تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل إلى وسط الاستزراع. استخدام فك الإنسان المتجمعة كسيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات الثقافة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الوسط الثقافي إلى كل بئر من العقيمة، غير المطلية، مسطحة القاع البوليسترين لوحة 4 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، مكان بعناية واحد مرشح غشاء البولي مع حجم المسام من 5 ميكرون لكل بئر على أعلى المتوسطة. نقل لوحة أعدت إلى حاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ كو 2 ). تأكد من أن المرشح يبقى جافة على السطح العلوي ويطفو. ملاحظة: مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شفرة حلاقة، وقطع ما يقرب من 30 نصائح ماصة (حجم: 100 ميكرولتر) أبروسيماتلy 1 ملم من طرف ليؤدي إلى افتتاح أوسع. ضع النصائح مرة أخرى في رف ماصة طرف. </li></ol> 2. تشريح رذاذ ميتانيفريك في E11.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس في فترة الحوامل في E11.5 عن طريق خلع عنق الرحم (أو باستخدام طريقة وافقت عليها لجنة الأخلاق المحلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرحم والأجنة، كما وصفها براون وآخرون 6 . من هذه النقطة إلى الأمام، والعمل تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام رقم 5 ملقط الساعاتي، وقطع الجنين مباشرة تحت أركان. استخدام طبق بتري جديدة لكل الجنين. إزالة الساقين والذيل من الجنين. للقيام بذلك، والاستيلاء على الأنسجة المراد إزالتها مع زوج واحد من رقم 5 ملقط الساعاتي واستخدام نصائح الزوج الثاني لخفض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة كتلة الجهاز البطني، واستخدام نصائح من زوج من ملقط لفتح أفقيا جدار الجسم من الجنين في اتجاه منقاري إلى الذيلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع سطحيا، موازية ل tالأبهر الظهري. استخدام الدم المملوءة وبالتالي مرئية الظهري الأبهر للتوجه. بعناية فصل الجزء البطني من جدار الجسم من الجزء الظهري باستخدام نصائح ملقط مغلقة والوجه الجنين أكثر. قطع جدار الجسم أفقيا في اتجاه منقاري إلى الذيلية واستخدام الشريان الأورطي الظهري للتوجه، كما في الجانب السابق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم فصل جدار الجسم البطني من الجسم الظهري، والاستيلاء عليها مع زوج واحد من ملقط وسحب بعناية لإزالته، جنبا إلى جنب مع كتلة الجهاز. ملاحظة: أنلاجين ميتانيفريك عادة ما تبقى تعلق على جدار الجسم الظهري. فهي بيضاوية، ~ 200 ميكرون هياكل طويلة تقع على مستوى أطرافه الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد جدار الجسم الظهري مع زوج واحد من ملقط، مع الجانب البطني مواجهة. باستخدام زوج آخر من ملقط، والاستيلاء على الشريان الأورطي الظهري في نهاية منقاري وقشر بعناية الشريان الأورطي الظهري من جدار الجسم الظهري. ملاحظة: كلا الكلى ميتانيفريك البقاء عادة إرفاقإد، حتى، ال التعريف، ظهري، أورتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج واحد من ملقط، وقطع روسترالي إلى أنلاجين الكلى لإزالة الشريان الأبهر. ثم، فصل بعناية اثنين من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقشر بعناية الأنسجة غير المرغوب فيها من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط. الحرص على عدم إلحاق الضرر اللحمة المتوسطة، كما يمكن أن يؤدي الضرر في ضعف النمو وإقصاء إكسلانت من مزيد من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنلاجين الكلى بشكل منفصل باستخدام ماصة ميكروليتر وفتح ماصة واسعة مفتوحة في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتصفية غشاء البولي في لوحة 4 جيدا. ملاحظة: بسبب التوتر السطحي، وسوف تكون مغطاة إكسلانت مع طبقة رقيقة من المتوسطة. مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل من أنلاجين الكلى في وسط كل نصف منها من المرشح. نقل لوحة العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو 2 . ترك لوحة في الحاضنة حتى رود ميتانيفريكمن الجنين المقبل على استعداد لوضعها على التصفية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.3-2.9.1 لكل جنين. ملاحظة: مع بعض الممارسة، فإن إجراء تشريح يستغرق حوالي 5 دقائق لكل جنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنلاجين الكلى لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو 2 . </li></ol> 3. إعداد الكواشف للتثبيت وتلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (ث / ت)، حل بفا في 60 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني، واثارة باستمرار. بارد إلى درجة حرارة الغرفة واستخدام فلتر الورق لإزالة الجسيمات المتبقية. قسامة والحفاظ على 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري أو تجميد للتخزين على المدى الطويل. تنبيه: بفا سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المحددة في معايير السلامة المحلية والعمل في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستخدام حاويات النفايات المعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل بيرمابيليزاتيون، تمييع تريتون X-100في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى 0.3٪ (الخامس / الخامس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حجب الحل، إضافة 5٪ (الخامس / الخامس) الماعز المصل و 0.1٪ تريتون X-100 إلى برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة أزيد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). تخزين في 4 درجات مئوية. تنبيه: أزيد الصوديوم سامة. التعامل مع أزيد الصوديوم وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح. ملاحظة: عند استخدام الأجسام المضادة للتلطيخ، واستخدام مصل 5٪ من الأنواع تم اشتقاق الأجسام المضادة الثانوية من لجعل حجب الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع البيروكسيديز دوليتشور بيفلوروس راصة 1: 200 في حجب الحل. تمييع Alexa488 مترافق ستريبتافيدين 1: 200 في حجب الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (انظر جدول المواد)، إضافة 0.1 غرام من الكحول القابلة للذوبان في الماء بولي فينيل موكودزيف / مل إلى 25٪ (ث / ت) الجلسرين في 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5) . الحرارة إلى 50 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 1 ساعة، يبرد، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0-8.5 باستخدام 1M هيدروكسيد الصوديوم. تجنب تركيزات أعلى هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 100 ميكروغرام / مل N- بروبيلغالات والثيميروسال إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). يحرك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: ثيميروسال سامة. التعامل معها وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء المتوسطة التضمين في أنابيب 50 مل، وتوازن الدوار، وأجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. صب حل واضح في أنابيب 15 مل وتجاهل بيليه. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. مرة واحدة إذابة، والحفاظ على الحل في 4 درجات مئوية. الدافئة إلى ~ 30 درجة مئوية مباشرة قبل الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العديد من الشرائح الزجاجية كما المرشحات مع إكسلانتس هي التي شنت. لهذا، الغراء اثنين كوفرسليبس الصغيرة، 18 × 18 ملم، على جانبي الشريحة الزجاجية باستخدام لاصقة فورية، وترك مساحة 15 ملم ~ للمرشح بينهما. </li></ol> 4. التثبيت وتلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة زراعة من 3أيام في المختبر (ديف)، وإزالة لوحات من الحاضنة ونضح بعناية وسط الثقافة من كل بئر باستخدام ميكروبيبيت. تأكد من عدم لمس فلتر والحفاظ على فتح طرف نحو جدار البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني لكل بئر. المرشحات سوف تطفو على تثبيتي. باستخدام ميكروبيبيت، إضافة بعناية بفا تثبيتي قطرة للغمر المرشحات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: بالنسبة لجميع الخطوات التالية، يجب الحرص على عدم غسل إإكسبلنتس من التصفية. الحفاظ على فتح طرف ماصة نحو جدار البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بفا وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، غمر مرشح. إضافة 500 ميكرولتر من حل بيرمابيليزاتيون إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من حجب الحل لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل حظر مع250 ميكرولتر من البيروكسيديز دوليكوروس بيفلوروس راصة المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل بلاتلوروس دوليتشوروس الجلوتين وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من Alexa488 مترافق ستريبتافيدين المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. ملاحظة: ويتحقق أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء عند حضانة عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. باستخدام ملقط، ونقل المرشحات إلى الشرائح الزجاجية المعدة، مع إإكسبلانتس مواجهة. جبل مع ~ 50-100 ميكرولتر من تضمين المتوسطة. تغطية مع 60 ملم طول رقم 1.5 كوفرسليبس. السماح حل المتوسطة التضمين لتصلب لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. انتقل إلى التصوير أو تخزين الشرائح، ملفوفة في احباط، في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة مع المجهر إبيفلورزنس إبيفلورزنس 7 &lt;/ سوب&gt; مقترنة بمصباح زئبق واستخدام وحدة مرآة للإثارة الزرقاء (ممر علوي للإثارة، 460 - 495 نانو متر، ومرآة ثنائية اللون، و 505 نانو متر، وممر اجتياز للانبعاثات، و 510 - 550 نانومتر)، و 20X من العدسات، فتحة. </li></ol>

<ol><li>Saxén, L. <a target="_blank" href="http://admin.cambridge.org/fk/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/organogenesis-kidney">Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series</a>. 19, Cambridge University Press. (1987).</li>
<li>Lindström, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+%CE%B2-catenin%2C+BMP%2C+PTEN%2C+and+Notch+signalling+patterns+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron.</a> eLife. 4, e04000(2015).</li>
<li>Peuckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Eph%2FEphrin+signaling+controls+several+phases+of+urogenital+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development.</a> Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).</li>
<li>Pasquale, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph+receptor+signalling+casts+a+wide+net+on+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+Is+a+Multifunctional+Coreceptor+that+Integrates+Diffusible-+and+Contact-Axon+Guidance+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals.</a> Cell. 148 (2), 568-582 (2012).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Cells+from+the+Nephrogenic+Zone+of+the+Embryonic+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney.</a> J Vis Exp. (50), e2555(2011).</li>
<li>Olympus Support. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817">http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817</a> (2016).</li>
<li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401300207/abstract">Inductive interaction in the development of the mouse metanephros.</a> J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).</li>
<li>Saxén, L., Toivonen, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/38101">Primary Embryonic Induction</a>. , Academic Press. London. (1962).</li>
<li>Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+kidney+mesenchyme+in+an+experimental+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Morphog%22%5BJournal%5D)">Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system.</a> Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).</li>
<li>Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+FGF+and+BMP+signaling+pathways+regulates+development+of+metanephric+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme.</a> Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).</li>
<li>Perälä, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema4C-Plexin+B2+signalling+modulates+ureteric+branching+in+developing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney.</a> Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).</li>
<li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis%2C+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+exp+Morph%22%5BJournal%5D)">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).</li>
<li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 271, 98-108 (2004).</li>
<li>Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel%2C+Low-Volume+Method+for+Organ+Culture+of+Embryonic+Kidneys+That+Allows+Development+of+Cortico-Medullary+Anatomical+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization.</a> PLoS One. 5 (5), e10550(2010).</li>
<li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li>
<li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li>
<li>Saxén, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3328727">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li>
<li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li>
<li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وتصف هذه المخطوطة طريقة لعزل أنلاجين ميتانيفريك النامية من جنين الماوس وثقافة أساسيات الجهاز. هذا الأسلوب هو تقنية قياسية، كما وضعتها غروبستين 8 و ساكسن 9 ، 10 ، وتم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من الآخرين 11 ، 12 . نجاح طريقة يعتمد أساسا على مدة تشريح، كما بقاء إكسلانت و المحتملة الاستقرائية تنخفض مع وقت تشريح لفترات طويلة. يجب أيضا أن تؤ...

كلية الثدييات مشتقة من بنيين بدائيين من أصل الأديم المتوسط: برعم الحالب الظهاري الأنبوبي واللحمة المتوسطة الكلىية. أثناء تكوين الكلى ، يغزو برعم الحالب اللحمة المتوسطة الكينية والفروع لتشكيل نظام التجميع. يؤدي اللحمة المتوسطة metaneplery إلى ظهور العناصر الظهارية للنفرون. تحدث هذه العمليات في توقيت دقيق وبطريقة منسقة مكانيا وتبدأ بآليات حثية متبادلة. يتواصل كلا مكوني الأنسجة ويؤثران على تشكل الخلايا الأخرى. 
في عشرينيات القرن العشرين ، كان بويدن هو الذي قام بانسداد القناة الكلية المتوسطة في الجسم الحي في الدجاج ، مما يوفر أول مؤشر على التفاعلات الاستقرائية حيث تفشل الأريمة الكلوية المنفصلة في التمييز بين < فئة sup = 'xref'>1. في نفس الوقت تقريبا ، تم نشر المحاولات الناجحة الأولى لاستزراع أساسيات الكلى للدجاج في قطرة معلقة. بعد ذلك ، تم تطوير ثقافة الأعضاء لدراسة تفاعلات الأنسجة في تكوين الأعضاء في الثدييات. في الخمسينيات من القرن العشرين ، طور غروبشتاين تقنية يمكن من خلالها زراعة أساسيات metanephric على مرشح. تم تعديل هذه التقنية بواسطة Saxén ، الذي وضع المرشح على شاشة من نوع Trowell في طبق ثقافة 1. على مر السنين ، ظهرت العديد من التعديلات والتطبيقات لثقافة الأعضاء. تعتمد الطريقة الموضحة هنا على تقنية Saxén ولكنها مبسطة ، حيث تطفو المرشحات بحرية على الوسط ويتجاوز قطر الثقافة بئر قطر المرشح قليلا ، مما يحد من حركة المرشح غير المرغوب فيها.
 ثقافة الأعضاء الكاملة هي أداة كلاسيكية ورخيصة ورخيصة ولكنها بسيطة ولكنها قوية للتحقيق في العمليات الخلوية والاتصال بين الخلايا أثناء تكوين الأعضاء. تسمح زراعة الأعضاء بالعلاج بالعوامل البيولوجية ، مثل عوامل النمو والأجسام المضادة وقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى والفيروسات والببتيدات ، وكذلك بالمركبات الصيدلانية والمواد الكيميائية الأخرى. أيضا ، يمكن دراسة وظيفة الجينات باستخدام التحويلات المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا أو باستخدام تقنية تعطيل الجينات المحفزة ، مثل نظام Cre-loxP. هذا يسمح بدراسة الطفرات الجينية التي تسبب الفتك الجنيني قبل نمو الكلى. يمكن أيضا دمج ثقافة الأعضاء مع وضع العلامات الفلورية لوظيفة الجينات أو تتبع النسب وتقنيات التصوير الحديثة ، والتي تتيح المراقبة في الوقت الفعلي لسلوك الخلية < فئة الدعم = 'xref'>2.
في المثال المحدد المقدم هنا ، تم التحقيق في تأثير إشارات مستقبلات Eph المنشطة ب EphrinB2 على التشكل المتفرع لبرعم الحالب. اقترح مورفولوجيا الفئران ذات الضربة القاضية المزدوجة EphA4 / EphB2 العديد من العيوب الشديدة في نمو الكلى ، والتي كان من الممكن اكتشافها في وقت مبكر من اليوم الجنيني 11 (E11) وشملت برعم الحالب والحالب والقناة الكلوية المشتركة< فئة sup = 'xref'>3. يتطلب إرسال الإشارات عبر مستقبلات Eph تجميع ثنائي مستقبلات الترابط 4. للإفراط في تنشيط إشارات Eph ، تم زراعة أساسيات الكلى من أجنة الفئران E11.5 في وجود EphrinB2-Fc المؤتلف العنقودي. EphrinB2 هو رابط معروف لمستقبلات EphA4 ، والذي يتم التعبير عنه في أطراف براعم الحالب < فئة sup = 'xref'>3.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Supplement Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS والكالسيوم والمغنيسيوم Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>14040117 استخدامها لتشريح</td></tr><tr><td>holo-Transferrin البشري</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS -G) (100x)</td> <td>ثيرمو فيشر</td><td>41400045</td><td></td>العلم</tr><tr><td>بارافورمالديهايد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>محلول الأمفوتريسين ب</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>تريتون X-100</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>مختبرات ناقلات</td><td>Dolichorus Biflorus Agglutinin Biotinylated</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 الستربتافيدين</td><td>جاكسون المناعي المترافق</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>الفأر المؤتلف Ephrin-B2 Fc Chimera Protein ، CF</td><td>R & D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>المؤتلف البشري IgG1 FC ، CF</td><td>R & D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للإنسان IgG Fc الأجسام المضادة</td><td>R & D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>أقراص ملحية مخزنة بالفوسفات</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>تستخدم للتثبيت والتلوين المناعي</td></tr><tr><td>Dumont # 5 ، أطراف biologie ، INOX ، 11 سم</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>هناك حاجة إلى 2 زوج من الملقط</td></tr><tr><td>مقص قزحية ، مستقيم ، 12 سم</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>ملقط خلع الملابس ، مستقيم ، رقيق ، 13 سم</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بتري معالج Nunclo Delta</td><td>معالج Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 مرشح غشاء Isopore ، بولي كربونات ، ماء ، 5.0 & micro ؛ م ، 13 مم ، أبيض ، عادي</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon متعدد الأطباق 4 آبار ، غطاء</td> مجهر <td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td>ذو قاع مسطح</tr><tr><td>بسمك 24 × 50 مم. رقم 1.5H 0.17 +/- 0.005 مم</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>غطاء نظارات رقم 1.5 ، 18 مم × 18 مم</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>شرائح ~ 76 × 26 × 1 ، 1/2-w. أرضي عادي</td><td>Nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>شفرات الحلاقة</td><td>VWR VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنابيب الطرد المركزي</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنابيب الطرد المركزي</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>ورق ترشيح نوعي مسبق مسبقا Whatman ، درجة 113 فولت ، منظار</td><td>أبحاث Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>ذو المرحلة الثابتة</td><td>منظار أوليمبوس</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>أسود 6 فئران فطرية ، ذكر ، C57BL / 6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>أسود 6 فئران فطرية ، أنثى ، C57BL / 6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>جرينف مجهر ستيريو</td><td>لايكا</td><td>S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

الهدف من هذا البروتوكول هو لوصف طريقة لتشريح، العزلة، والثقافة من أساسيات ميتانيفريك الماوس. خلال تطور الكلى الثدييات، واثنين من الأنسجة الاصلية، وبرعم الحالب والميزينشيم ميتانيفريك، والتواصل وتحفيز بالمثل آليات الخلوية لتشكيل في نهاية المطاف نظام جمع و نيفرونس الكلى. كما تنمو الأجنة الثدييات داخل الرحم وبالتالي لا يمكن الوصول إليها للمراقب، وقد وضعت ثقافة الجهاز. مع هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة التفاعلات الظهارية اللحمة المتوسطة والسلوك الخلوي خلال أورغانوجينيسيس الكلى. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من أصل الكلى الخلقية والتشوهات الجهاز البولي التناسلي. بعد تشريح دقيق، يتم نقل أساسيات ميتانيفريك على مرشح الذي يطفو على وسط الاستزراع ويمكن أن تبقى في حاضنة ثقافة الخلية لعدة أيام. ومع ذلك، يجب أن يكون على بينة من أن الشروط هيالاصطناعي ويمكن أن تؤثر على عملية التمثيل الغذائي في الأنسجة. أيضا، اختراق المواد اختبار يمكن أن تكون محدودة بسبب المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي موجودة في إكسلانت. ميزة رئيسية واحدة من ثقافة الجهاز هو أن المجرب يمكن الحصول على إمكانية الوصول المباشر إلى الجهاز. هذه التكنولوجيا هي رخيصة وبسيطة، ويسمح لعدد كبير من التعديلات، مثل إضافة المواد النشطة بيولوجيا، ودراسة المتغيرات الجينية، وتطبيق تقنيات التصوير المتقدمة.

وقد استمدت أنلاجين الكلى ميتانيفريك من الحوامل الأسود -6 الفئران إنبريد في E11.5 وتم تربيتها. بعد 3 أيام، برعم الحالب قد تشعبت تصل إلى 5 مرات، مما أدى إلى تشعب من برعم الحالب على شكل حرف T في البداية. تم تصوير كل مستكشف، وتم تحديد أعداد القطاعات ونقاط النهاية لتحديد الأجيال المتفرعة وحساب عدد نقاط النهاية لكل فرع ( الشكل 1 ). وقد تم التوصل إلى الجيل الرابع في 8٪ فقط من المستكشفات المعالجة مقارنة مع 35٪ من إإكسبلنتس السيط...

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وزراعة أساسيات ميتانيفريك من الأجنة الماوس.

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في عزل واستنبات البراعم الميتانيفيرية من أجنة الفئران، ومراقبة تأثيرات معالجات محددة على مورفولوجيا تفرع البرعم الحالبى. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة عن أسئلة رئيسية في تخلق أعضاء الكلية حول التحكم في التخلق المورفولوجي للتفرع الأنبوبي، وحول التفاعلات بين الظهارة والميزنشيم، وعن أصل التشوهات الخلقية. وتكمن المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسهل الوصول المباشر إلى العضو؛ كما أنها بسيطة، وغير مكلفة، وسهلة التعديل.قبل البدء في عملية التشريح، استخدم ملاقط معقمة لوضع مرشح غشائي من البولي كربونات بمسامية 5 µm بعناية في كل بئر من أطباق ذات أربعة آبار تحتوي على 500 µL من وسط زراعة طازج. انقل الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة لقص حوالي 30 رأس ماص دقيق سعة 100 µL على بُعد 1 mm تقريباً من الطرف لتوسيع فتحات الرؤوس، ثم أعد الرؤوس إلى حامل رؤوس الماصات.عندما تصبح الرؤوس جاهزة، ضع جنيناً في اليوم الجنيني 11 1/2 في محلول PBS تحت مجهر تشريحي. استخدم طبقاً نظيفاً لكل جنين. وباستخدام ملاقط صانع ساعات مقاس 5، اقطع الجنين مباشرة تحت القوائم الأمامية.بعد ذلك، ثبّت القوائم باستخدام زوج من الملاقط، واستخدم زوجاً ثانياً من الملاقط لإزالة أنسجة القوائم. قم بإزالة الذيل بنفس الطريقة، واستخدم أطراف الملاقط لفتح جدار جسم الجنين جانبياً وسط

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسي ، والذي يسمح للتلاعب كفاءة الممرات مرشح.

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

يوصف أسلوب السماح للتلاعب الدوائية المباشرة للأجنة الفئران خلال neurulation ان يتجاوز التمثيل الغذائي للأمهات. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسة جوانب مختلفة من neurulation من خلال تغيير نقطة زمنية وكيل الدوائية.

اختتام العصبية أنبوب في الثقافة ماوس الأجنة الجامعة

يصف هذا الفيديو طريقة عزل الكبيبات السليمة من كلى الفئران. يمكن استخدام الكبيبات المغلفة والمفكسورة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لزراعة نتاج الخلايا الظهارية الجداري من كلية الفئران.

عزل الكبيبات: تقنية للحصول على كبيبات سليمة من كلية الفئران

المصل المستخدمة في الثقافات الجنين يحتوي على مكونات غير معروفة يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب وخاصة في الدراسات التي تنطوي على إشارات التفاعلات. نحن هنا لاستخدام الاوكسيجين نظام الثقافة المصل خالية وتبين أن الأجنة منتصف الحمل الماوس تربيتها لمدة 16-40 ساعة تظهر التنمية المورفولوجية مماثلة لأجنة النامية في الرحم.

الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل

تلعب الخلايا العصبية الدوبامينية دورا تنظيميا حيويا في الدماغ. يرتبط فقدانهم بمرض باركنسون. في هذا الفيديو ، نوضح كيفية توليد الثقافات الأولية للخلايا العصبية الدوبامينية المركزية من الدماغ المتوسط للفأر الجنيني. هذه الثقافات مفيدة لدراسة الضعف الشديد لهذه الخلايا العصبية لضغوط مختلفة.

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

هندسة الأنسجة بنيات الكلوي توفر حلاً للنقص في الجهاز والآثار الضارة للغسيل الكلوي. هنا، يمكننا وصف بروتوكول للصغير تشريح الكليتين مورين لعزل قطاعات كورتيكو النخاع. يتم زرع هذه الأجزاء في ثوابت خالية من السقالة الخلوية، تشكيل أورجانويدس الكلوي.

ميكروديسيكشن شرائح الأنسجة الكلوية الأولية، وإدماج مع تكنولوجيا بناء رواية خالية من السقالة

هنا، نحن نقدم تقنية microsurgical رواية لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الماوس الجنين ه13 ganglionic نيافة.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

توضح هذه المقالة طريقة لاستزراع وتحليل الخلايا الظهارية الكبيبية خارج الخلايا المغلفة من glomeruli معزولة عن الكلى الماوس. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة المسارات التي ينطوي عليها انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة.

Glomerular Outgrowth كما مُجرا السابق Vivo لتحليل المسارات المشاركة في تنشيط الخلية الظهارية Parietal

يصف هذا العمل طريقتين لدراسة تطور الأعضاء، إعداد زينوزراعة محسنة على الغشاء chorioallantoic (CAM) من أجنة الطيور التي تسمح لالأوعية الدموية من الأعضاء الجنينية المستزرعة وorganoids ورواية ثابتة z الاتجاه طريقة ثقافة الجهاز مع الشروط التجريبية المعدلة التي تسمح للتصوير البؤري الفاصل الزمني عالي الدقة.

التحسين من الكلين Organoid وOrganotypic الثقافة للعوعية ، التنمية الموسعة ، وتحسين التصوير المجهري

تعلم عزل وزراعة الأجزاء الكلوية الأولية من أجنة الفئران لدراسة تفرع القنوات البولية. هذه الطريقة البسيطة تساعد الباحثين على فهم تكوين الكلى والتشوهات الخلقية.

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

استكشف المزيد من الفيديوهات