تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا النسب الغضروفية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة المشتقة من الدم المحيطي البشري ، أو خلايا IPS. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد الغضروف حول استخدام خلايا الدم المحيطية المشتقة من المريض كخلايا C لتوليد خلايا IPS لإصلاح الغضروف. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها قابلة للتكرار بسهولة ، ويحدث تمايز الخلايا الغضروفية في المصل والظروف الخالية من xeno.

ابدأ بطلاء خلايا IPS البشرية في وسط IPSC بشري بسعة أربعة ملليلتر على طبق زراعة أنسجة بحجم 60 ملم يحتوي على طبقة أحادية من خلايا تغذية الخلايا الليفية الجنينية المشععة. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. عندما تكون الخلايا الجذعية متقاربة بنسبة 80 إلى 90 في المائة ، قم بفصل الخلايا بمحلول ديسبيس للثقافة الفرعية.

بعد ممرين إلى ثلاثة ممرات ، استخدم إبرة زجاجية مسحوبة بالنار لتشريح مستعمرة IPSC غير المتمايزة بنسبة 80 إلى 90 في المائة إلى أجزاء أصغر ، ونقل ما لا يزيد عن 100 قطعة من زراعة الخلايا إلى طبق بتري جديد غير ملتصق بحجم 100 ملم يحتوي على 10 مل من وسط تكوين الجسم الجنيني. التفكك الميكانيكي أفضل من الهضم التلقائي لأنه يقلل من تلف الخلايا لأجزاء صغيرة من الخلايا الآن ليتم نقلها إلى حاوية الثقافة الجديدة ، والإعلان عن التخلص اليدوي من الخلايا المغذية ، التي تثبط تمايز الخلايا IPS البشرية. أعد خلايا IPS البشرية إلى حاضنة زراعة الخلايا.

بعد يومين ، قم بإمالة الطبق للسماح للأجسام الجنينية بالاستقرار ، واستبدل بعناية ثلاثة ملليلتر من وسط تكوين الجسم الجنيني بأربعة ملليلتر من وسط الثقافة القاعدية الطازجة. بعد 10 أيام ، ستتشكل الأجسام الجنينية. قم بتغطية طبق جديد سعة 100 ملم بأربعة ملليلتر من الجيلاتين 0.1 في المائة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

انقل الأجسام الجنينية مع المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، واترك الأجسام تستقر لمدة أربع إلى خمس دقائق. استنشق كل ما عدا آخر 0.5 مل من الوسط ، وأعد تعليق الأجسام الجنينية في 10 مل من وسط الثقافة القاعدية الطازجة. عندما يصلب الجيلاتين ، تخلص من الجيلاتين.

ثم قم بزرع الخلايا في الطبق المغطى بالجيلاتين ، وضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 10 أيام في المزرعة ، سوف تتمايز الأجسام الجنينية إلى نتوء خلايا الخلايا الليفية. للحث على تمايز الخلايا الغضروفية ، اغسل المزرعة باستخدام DPBS وافصل الخلايا بثلاثة ملليلتر من 0.25 في المائة من التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

عندما ترفع الخلايا من قاع اللوحة ، قم بتحييد التفاعل بأربعة ملليلتر من وسط الثقافة القاعدية الطازجة ، وقم بمعايرة المزرعة برفق من خمس إلى 10 مرات. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة شبكية من النايلون سعة 70 ميكرون ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم قم بزرع الخلايا في صفيحة جديدة مطلية بالجيلاتين مقاس 100 ملم في 10 ملليلتر من وسط الثقافة القاعدية الطازجة.

عندما تصل المزرعة إلى 90 إلى 100 في المائة من التقاء ، احصد الخلايا بثلاثة ملليلتر من 0.25 في المائة من التربسين EDTA كما هو موضح للتو للعد. انقل ثلاثة أضعاف 10 إلى الكمية الخامسة من الخلايا إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط التمايز الغضروني.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وضع الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 21 يوما دون إزعاج الحبيبات. قد تتجمع الخلايا الغضروفية في المختبر ، مما ينتج عنه مقاييس مميزة خارج الخلية عندما تكون في ظل ظروف ثقافة عالية الكثافة. بعد 21 يوما في الثقافة ، ستتشكل حبيبات غضروفية لخلية IPS البشرية.

بعد 21 يوما من الاستزراع ، تكون الخلايا الغضروفية البشرية IPSC إيجابية للأزرق الألسيا والتولودين في التلوين الأزرق ، مما يشير إلى تمايز غضروفي ناجح لحبيبات HIPSC. يؤكد التحليل الكيميائي المناعي للكولاجين الثاني والكولاجين 10 أيضا نمطهما الظاهري الشبيه بالخلايا الغضروفية. يكشف تحليل الجليكوزامينوجليكان الكبريتات أن محتويات الجليكوزامينوجليكان الكبريتية للخلايا يتم تنظيمها بشكل كبير في الكريات الغضروفية IPSC البشرية ، مقارنة بالخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية IPSC البشرية ، والأجسام الجنينية ، وخلايا IPS البشرية غير المتمايزة.

علاوة على ذلك ، تظهر الخلايا الغضروفية البشرية IPSC مستوى عال من التعبير الجيني لنسب الغضروف وعلامات الخلايا الغضروفية المتمايزة تماما ، مما يشير إلى تحقيق تمايز غضروفي ناجح. طريقة زراعة متعددة الخطوات تستخدم للتمييز بين الخلايا التفاعلية المستقلة للخلايا البشرية إلى خلايا غضروفية ، بما في ذلك التمايز التلقائي عن طريق تكوين EB ، ونمو الخلايا من EBs ، وزراعة الخلايا أحادية الطبقة بعد زراعة الخلايا ، وزراعة الحبيبات ثلاثية الأبعاد. يتم تقييم النمط الظاهري للخلايا الغضروفية عن طريق التحليل النسيجي والتحليل الكيميائي الحيوي والتعبير الجيني الغضروف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام طريقة ثقافة متعددة الخطوات لتحفيز تمايز خلايا IPS البشرية إلى الخلايا الغضروفية. يمكن أن تكون هذه التقنية أكثر تحديدا للمريض وفعالة من حيث التكلفة.