تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

يتمثل الهدف العام من استخدام الترحيل الكهربائي الأصلي (native electrophoresis) بالتزامن مع المقايسات داخل الهلام (in-gel assays)، والبصمة المناعية (immunoblotting)، والاستخلاص الكهربائي الأصلي (native electroelution) في الحفاظ على تجمعات المعقدات الفائقة الميتوكوندرية وتحليلها. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على كيفية تجميع المعقدات البروتينية لسلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا إلى معقدات فائقة اعتماداً على عوامل عديدة، بما في ذلك الاحتياجات الطاقة الحيوية والظروف الفسيولوجية والمرضية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه في حال تنفيذها بشكل صحيح، يتم الحفاظ على السلامة الفسيولوجية والوظيفية للمعقدات الفائقة الميتوكوندرية طوال عملية العزل الطويلة.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً لدراسة ديناميكيات تجميع المعقدات الفائقة وتحليل المعقدات البروتينية في الغشاء البلازمي، وكذلك في الأغشية داخل الخلوية الأخرى. عند التحضير للمقايسات داخل الهلام، من الضروري للغاية ألا تكون جميع الأجزاء المستخدمة في الرحلان الكهربائي الأصلي ملوثة بالمنظفات، لأنها ستؤدي إلى تفكك المعقدات الفائقة للميتوكوندريا. اقطع مساراً واحداً أو أكثر من هلام أصلي شفاف وانقل هذه المسارات إلى وعاء مُسمى.

لإجراء مقايسة المركب-1 (complex-1 assay)، اخلط 10 milliliters من محلول منظم المقايسة مع 25 milligrams من نترو الأزرق تيترازوليوم (nitro blue tetrazolium) و100 microliters من NADH بتركيز 10 milligrams per milliliter. أضف هذا الخليط إلى مسار هلام الناتيف الشفاف المستأصل أو المنطقة المراد دراستها. تتبع ظهور النطاقات الزرقاء بعد الرج اللطيف على جهاز الهزاز (rocker) لمدة ثلاث دقائق على الأقل.

بعد ذلك، يتم تثبيت الهلام في 10 إلى 20 مليليتر من محلول حمض الأسيتيك أو غسله في 5 ملي مولار Tris pH 7.4 لإيقاف التفاعل. يتم التقاط صور لغرض التوثيق. ولإجراء مقايسة complex-5، يتم الحصول على هلام، أو مسار، أو منطقة اهتمام من هلام native أزرق أو هلام native شفاف.

قم بتحضين العينة لمدة ساعتين مع الرج اللطيف في 10 إلى 20 ملليلتر من منظم المقايسة، مع إضافة 5 ميكروغرام/ملليلتر (زائد أو ناقص) من الـ oligomycin في درجة حرارة الغرفة. وبعد التحضين، استبدل المنظم بـ 14 ملليلتر من منظم مقايسة جديد. ثم أضف، بالترتيب، 190 ميكرولتر من كبريتات المغنيسيوم بتركيز 1 مولار، و 27.28 ملغ من نترات الرصاص، و 60 ملغ من ATP، و 75 ميكرولتر من الـ oligomycin.

قم بالتحضين مع الرج اللطيف وراقب ظهور راسب أبيض، حيث ستظهر نطاقات غير معتمدة على المعقد-5 في الهلامات المعالجة بالأوليغوميسين. قم بتثبيت الهلام في مثبت يعتمد على الميثانول لأن المحاليل الحمضية ستؤدي إلى إذابة راسب الرصاص. صوّر النتائج ثم تابع بعملية نقل البروتين واللطخة المناعية، كما هو موضح في البروتوكول النصي.

في يوم الاستخلاص الكهربائي، ضع مرشحاً (frit) في قاع كل أنبوب زجاجي سيتم استخدامه. إذا لزم الأمر، ضع الأنبوب الزجاجي في محلول الاستخلاص المنظم (elution buffer) وادفع المرشح من الداخل إلى قاع الأنبوب. ثم أدخل الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على المرشح في وحدة جهاز الاستخلاص الكهربائي (Electro-Eluter).

قم بترطيب السدادة المطاطية (grommet) باستخدام محلول الاستخلاص (elution buffer) ثم أدخل الأنبوب الزجاجي في مكانه. تأكد من أن نهايات الأنابيب الزجاجية محاذية للسدادة المطاطية. أغلق السدادات المطاطية الفارغة باستخدام سدادات إحكام (stoppers).

بعد ذلك، ضع غطاء غشاءً مبللاً في أسفل المهايئ السيليكوني واملأ المهايئ بمحلول الاستخلاص المنظم. استخدم الماصة لسحب ودفع المحلول المنظم داخل المهايئ ببطء لإزالة أي فقاعات هوائية حول غشاء الديلزة. مرر المهايئ المملوء بالمحلول المنظم إلى أسفل الأنبوب الزجاجي.

بعد ذلك، قم بإزالة جميع الفقاعات التي تظهر على المرشح المسامي (frit) داخل الأنبوب الزجاجي. املأ كل أنبوب زجاجي بمحلول الاستخلاص المنظم (elution buffer). ضع الحزم المقطوعة من هلام BN-PAGE داخل الأنابيب الزجاجية.

قُم بتقطيع القطع الكبيرة إلى قطع أصغر. تأكد من أن ارتفاع الملء داخل الأنبوب الزجاجي يبلغ حوالي 1 cm. بعد ذلك، ضع الوحدة بأكملها في الخزان.

أضف حوالي 600 milliliters من منظم الاستخلاص البارد إلى الخزان. تأكد من غمر أغطية المحول السيليكونية في المنظم. ضع قضيب تحريك في قاع الخزان قبل استخلاص البروتينات لمدة أربع ساعات بجهد 350 volts في غرفة باردة.

بعد اكتمال عملية الشطف، قم بإزالة وحدة Electro-Eluter من خزان المحلول المنظم ووضعها في حوض أو وعاء. إذا تم استخدام سدادة، فقم بإزالتها لتفريغ غرفة المحلول المنظم العلوية. قم بإزالة المحلول المنظم من كل أنبوب زجاجي وتخلص منه.

تأكد من بقاء المهايئ السيليكوني في مكانه، وعدم تعريض السائل الموجود أسفل القرص المسامي للاضطراب أو الرج. بعد ذلك، قم بإزالة المهايئ السيليكوني بعناية، جنباً إلى جنب مع غطاء الغشاء، من الجزء السفلي للأنبوب الزجاجي. ثم انقل محتويات الغطاء السيليكوني باستخدام الماصة إلى أنبوب دقيق (microtube).

باستخدام 200 µL أخرى من محلول الاستخلاص (elution buffer)، اشطف الغطاء السيليكوني وأضفه إلى الأنبوب الدقيق (microtube). كرر هذه العملية لجميع الأنابيب الزجاجية. حافظ على أغطية الأغشية القابلة لإعادة الاستخدام عن طريق وضعها في محلول استخلاص يحتوي على 0.5 mg/mL من أزيد الصوديوم (sodium azide)، ثم احفظها في الثلاجة.

يتم هنا تصور المعقدات الفائقة من ميتوكوندريا القلب عن طريق مقايسات الهلام. تُستخدم مسارات هلام الطبيعة الصافي في مقايسات الهلام للمُعقد-1 والمُعقد-5. ويمكن تقييم خصوصية الإشارة باستخدام المثبطات، مثل الأوليغومايسين لإنزيم ATP-synthase.

توفر المقاييس داخل الهلام معلومات تتعلق بحجم المعقد البروتيني، مع نشاط المعقد-1 أو المعقد-5، ولكنها لا توفر معلومات حول تركيبها. يظهر هلام الـ blue native حزمًا من المعقدات البروتينية التي يمكن استئصالها من أجل الشطف الكهربائي. وبعد عملية الشطف الكهربائي، تُستخدم المادة المشروبة لإجراء مزيد من التحاليل، مثل المقاييس داخل الهلام، وصبغ البروتينات المشروبة بالفضة عن طريق الرحلان الكهربائي الطبيعي أو المسخ، وبصمة ويسترن.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثلاثة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح. وتشمل هذه الأيام الثلاثة عزل الميتوكوندريا، وإجراء الفصل الكهربائي الأزرق الأصلي (blue native maxi electrophoresis) طوال الليل، واللطخة المناعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتحديد المجمعات الفائقة للميتوكوندريا باستخدام الفصل الكهربائي الأصلي، والمقايسات داخل الهلام (in-gel assays)، والاستخلاص الكهربائي (electroelution).

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن المعقدات الميتوكوندريا الفائقة (mitochondrial supercomplexes) هشة؛ لذا يجب تقليل عمليات تجميد وإذابة العينات إلى أدنى حد ممكن. كما يجب إجراء الفصل الكهربائي الأصلي (Native electrophoresis) والاستخلاص الكهربائي (electroelution) على الثلج أو في الغرفة الباردة.

تمتد تداعيات هذه التقنيات إلى ما هو أبعد من تحديد التكوين الفيزيائي لكل معقد فائق. وبما أن المعقدات الفائقة يتم التقاطها في شكلها الأصلي، فإنه يمكن إجراء اختبارات وظيفية. وبعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الميتوكوندريا لإعادة تقييم فهم نشاط نقل الإلكترونات في الميتوكوندريا وتبعات ذلك على المرضى الذين يعانون من أمراض الميتوكوندريا.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل HPLC، أو مطيافية الكتلة، أو المجهر الإلكتروني، أو تثبيت الرقعة (patch clamping) للإجابة على أسئلة إضافية مثل التركيب الجزيئي، أو البنية، أو الخصائص الفيزيولوجية الكهربائية للمعقدات البروتينية المعزولة.