تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

الهدف العام من الرحلان الكهربائي الأصلي جنبا إلى جنب مع المقايسات داخل الهلام ، والنشاف المناعي ، والشطف الكهربائي الأصلي هو الحفاظ على تجميع المجمعات الفائقة للميتوكوندريا وتحليلها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن كيفية تجمع مجمعات البروتين في سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا في مجمعات فائقة اعتمادا على العديد من العوامل ، بما في ذلك احتياجات الطاقة الحيوية والظروف الفسيولوجية والمرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يتم الحفاظ على السلامة الفسيولوجية ووظائف المجمعات الفائقة للميتوكوندريا طوال عملية العزل الطويلة.

يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة ديناميكيات التجميع فائق التعقيد وتحليل مجمعات البروتين في غشاء البلازما ، وكذلك في الأغشية الأخرى داخل الخلايا. عند التحضير لفحوصات داخل الهلام ، من الأهمية بمكان ألا تكون جميع الأجزاء المستخدمة في الرحلان الكهربائي الأصلي ملوثة بالمنظفات ، لأنها ستساهم في تفكك المجمعات الفائقة للميتوكوندريا. قم بقص ممر واحد أو أكثر من هلام أصلي شفاف وانقلها إلى حاوية مصنفة.

لإجراء اختبار المركب -1 ، اجمع بين 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للفحص مع 25 ملليغرام من النيترو الأزرق تيترازوليوم و 100 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر NADH. أضف هذا إلى ممر الجل الأصلي الواضح أو منطقة الاهتمام. اتبع تطور العصابات الزرقاء بعد التحريض اللطيف على الروك لمدة ثلاث دقائق على الأقل.

بعد ذلك ، قم بتثبيت الجل في 10 إلى 20 مل من محلول حمض الأسيتيك أو اغسله في خمسة ملليمولار Tris pH 7.4 لإيقاف التفاعل. التقط صورا للتوثيق. لإجراء اختبار المركب -5 ، احصل على هلام أو ممر أو منطقة اهتمام من جل أصلي أزرق أو جل أصلي شفاف.

احتضان العينة لمدة ساعتين مع تحريض لطيف في 10 إلى 20 مل من المخزن المؤقت للفحص ، زائد أو ناقص خمسة ميكروغرامات لكل مليلتر من oligomycin في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، استبدل المخزن المؤقت ب 14 مل من المخزن المؤقت للفحص الجديد. ثم أضف بالترتيب 190 ميكرولتر من كبريتات المغنيسيوم المولية ، و 27.28 ملليغرام من نترات الرصاص ، و 60 ملليغرام من ATP ، و 75 ميكرولتر من oligomycin.

احتضن مع التحريك اللطيف وراقب الراسب الأبيض لأن العصابات الموجودة على المواد الهلامية المعالجة بالأوليغومايسين ستعطي نطاقات غير معقدة -5 أشرطة تابعة. قم بإصلاح الجل في مثبت قائم على الميثانول لأن المحاليل الحمضية ستذيب راسب الرصاص. قم بتصوير النتائج وتابعها بنقل البروتين والنشاف المناعي ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

في يوم الشطف الكهربائي ، ضع فريت في قاع كل أنبوب زجاجي لاستخدامه. إذا لزم الأمر ، ضع الأنبوب الزجاجي في عازلة الشطف وادفع الفريت من الداخل إلى أسفل الأنبوب. ادفع الأنبوب الزجاجي مع فريت في وحدة Electro-Eluter.

بلل الحلقة بمحلول شطف وحرك الأنبوب الزجاجي في مكانه. تأكد من أن قمم الأنابيب الزجاجية متساوية مع الحلقة. أغلق الحلقات الفارغة بسدادات.

بعد ذلك ، ضع غطاء غشاء مبلل في الجزء السفلي من محول السيليكون واملأ المحول بمخزن مؤقت للشطف. قم بسحب المخزن المؤقت والمحول ببطء لأعلى ولأسفل لإزالة أي فقاعات هواء حول غشاء غسيل الكلى. حرك المحول المملوء بمخزن مؤقت إلى أسفل الأنبوب الزجاجي.

ثم قم بإزالة جميع الفقاعات التي تظهر على الفريت داخل الأنبوب الزجاجي. املأ كل أنبوب زجاجي بمخزن الشطف. ضع الأشرطة المقطوعة من BN-PAGE في الأنابيب الزجاجية.

قطع قطع كبيرة إلى قطع أصغر. تأكد من أن ارتفاع التعبئة داخل الأنبوب الزجاجي يبلغ حوالي سنتيمتر واحد. ثم ضع الوحدة بأكملها في الخزان.

أضف حوالي 600 مل من محلول الشطف البارد إلى الخزان. تأكد من أن أغطية محول السيليكون مغمورة في المخزن المؤقت. ضع قضيب التحريك في قاع الخزان قبل تصفية البروتينات لمدة أربع ساعات عند 350 فولت في غرفة باردة.

بعد اكتمال الشطف، قم بإزالة وحدة Electro-Eluter من الخزان العازل وضعها في حوض أو وعاء. إذا تم استخدام سدادة ، فقم بإزالتها لتصريف الغرفة العازلة العلوية. قم بإزالة المخزن المؤقت من كل أنبوب زجاجي وتخلص منه.

تأكد من بقاء محول السيليكون في مكانه ، وأن السائل الموجود أسفل الفريت لا يزعج أو يهتز. بعد ذلك ، قم بإزالة محول السيليكون بعناية ، مع غطاء الغشاء من أسفل الأنبوب الزجاجي. ماصة محتويات غطاء السيليكون في أنبوب صغير.

باستخدام 200 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت للشطف ، اشطف غطاء السيليكون وأضفه إلى الأنبوب الصغير. كرر هذه العملية لجميع الأنابيب الزجاجية. حافظ على أغطية الأغشية القابلة لإعادة الاستخدام عن طريق وضعها في محلول شطف يحتوي على 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من أزيد الصوديوم ، وقم بتبريدها.

يتم تصور المجمعات الفائقة من الميتوكوندريا القلبية هنا عن طريق فحوصات داخل الجل. تستخدم ممرات الجل الأصلي الشفاف لإجراء فحوصات داخل الهلام للمركب 1 والمركب 5. يمكن تقييم خصوصية الإشارة باستخدام مثبطات ، مثل oligomycin ل ATP-synthase.

توفر المقايسات داخل الهلام معلومات تتعلق بحجم مركب البروتين ، مع نشاط مركب 1 أو معقد 5 ، ولكن ليس حول تكوينها. يظهر الجل الأصلي الأزرق نطاقات من مجمعات البروتين التي يمكن استئصالها من أجل الشطف الكهربائي. بعد الشطف الكهربائي ، يتم استخدام الشطف لمزيد من التحليل ، مثل المقايسات داخل الهلام ، وتلوين الفضة للبروتينات المملوءة عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي أو المتغير ، والنشاف الغربي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. تشمل هذه الأيام الثلاثة عزل الميتوكوندريا ، وإجراء الرحلان الكهربائي الأزرق الأصلي بين عشية وضحاها ، والتنشاف المناعي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتحديد المجمعات الفائقة للميتوكوندريا باستخدام الرحلان الكهربائي الأصلي ، والمقايسات داخل الهلام ، والشطف الكهربائي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المجمعات الفائقة للميتوكوندريا هشة. يجب تقليل تجميد العينات وإذابتها إلى الحد الأدنى. يجب أن يتم الرحلان الكهربائي الأصلي والشطف الكهربائي على الجليد أو في الغرفة الباردة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنيات إلى ما هو أبعد من تحديد التركيب المادي لكل مجمع فائق. نظرا لأن المجمعات الفائقة يتم التقاطها في شكلها الأصلي ، يمكن إجراء المقايسات الوظيفية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الميتوكوندريا لإعادة تقييم فهم نشاط نقل الإلكترون في الميتوكوندريا وعواقبه على المرضى الذين يعانون من أمراض الميتوكوندريا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل HPLC أو التحليل الطيفي الكتلي أو المجهر الإلكتروني أو لقط التصحيح للإجابة على أسئلة إضافية مثل التركيب الجزيئي أو الهيكل أو الخصائص الفيزيولوجية الكهربية لمجمعات البروتين المعزولة.