إعداد حويصلات غشاء البلازما من خلايا نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة لاحتمال استبدال السيتوبلازم العلاج

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم علاج بديل جديد للسيتوبلازم لعضلة المعدة للفئران باستخدام حويصلات غشاء البلازما ، أو PMVs المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفأر أو BMSCs. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بمكملات الخلايا بالسيتوبلازم الصغير من BMSC الأخرى عبر اندماج PMV يمكن أن يحسن أو حتى يعكس الأنماط الظاهرية الترابطية للعمر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تغليف PMV للخلوي BMSC ويمكن إحداثه على الفور عن طريق البثق الميكانيكي.

عندما تظهر هذه الطريقة ، فمن الأهمية بمكان لأنك تقوم بالبثق وبناء الخطوات يصعب تعلمها من خلال اختبار الامتلاك الفعلي. لتوليد PMVs ، أول زراعة للفأر BMSCs في وسط استزراع DMEM كامل في بئر واحد من ستة صفيحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، اشطف البئر ب 0.5 مل من PBS الخالي من الكالسيوم وافصل الخلايا ب 0.5 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA.

بعد ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية ، اضغط على اللوحة براحة اليد عدة مرات لتسهيل تفكك الخلايا وإيقاف الهضم باستخدام مليلتر واحد من وسط الاستزراع. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة خمسة ملليلتر للطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من وسط الثقافة الطازجة. ثم قسم الخلايا بين بئرين من صفيحة جديدة مكونة من ستة آبار وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بحصاد الخلايا من بئر واحد عن طريق هضم التربسين كما هو موضح للتو. إعادة تعليق الحبيبات في 0.5 مل من وسط الاستزراع الطازج بعد التجميع بالطرد المركزي. قم بتحميل الخلايا في حقنة أنسولين سعة مليلتر واحد وقم بتوصيل المحقنة بوحدة مرشح.

بسرعة على المكبس للضغط على الخلايا من خلال الفلتر ، وتخلص من الوسط المبثوق. ثم قم بتحميل وتوزيع 0.5 مل من وسط الثقافة الإضافي من خلال المرشح كما هو موضح للتو ، مع جمع الوسيط من البثق الثاني. ضع 150 ميكرولترا من الوسط الذي تم جمعه في طبق زجاجي سعة 35 مليلتر واترك الحويصلات تستقر لمدة 10 دقائق.

ثم تأكد من وجود PMVs تحت مجهر تباين الطور المقلوب المجهز بكاميرا CCD باستخدام عدسة موضوعية 20 مرة. لتتبع حاوية الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء في PMVs ، قم بتلطيخ ثقافة BMSC ملتصقة بنسبة 90٪ بصبغة ميتوكوندريا مناسبة أو مسبار محتمل لغشاء الميتوكوندريا على التوالي في وسط زراعة طازج لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام 0.5 مل من PBS لكل غسلة وحصاد الخلايا عن طريق هضم التربسين لتوليد PMV كما هو موضح للتو لتصورها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

لتتبع التوطين السيتوبلازمي لبروتينات PMV ، قم أولا بتخفيف ميكروغرامين من الحمض النووي البلازميد فائق الالتوا لشريط تعبير EGFP وستة ميكرولترات من كاشف التعدي الكاتيوني في أنابيب فردية سعة 0.5 ملليلتر تحتوي على 50 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. دوامة الأنابيب ، متبوعة بالطرد المركزي لفترة وجيزة. ثم أضف كاشف التعدي بحكمة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول الحمض النووي المخفف.

دوامة خليط تعداء الحمض النووي بقوة لمدة دقيقة واحدة ، متبوعا بدوران قصير في حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتغذية 30٪ من ثقافة BMSC المتجمعة في صفيحة من ستة آبار مع ملليلترين من وسط الاستزراع الطازج وأضف خليط الحمض النووي إلى الخلايا. بعد 48 ساعة من تعدادها ، قم بحصاد BMSC عن طريق هضم التربسين وقم بإعداد PMVs كما هو موضح للتو.

يمكن بعد ذلك تحليل PMVs عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام هدف الزيت 100 مرة. قبل حقن PMVs ، قم بتسمية مزرعة BMSC بصبغة تعقب الخلايا الفلورية الملطخة الغشائية في ملليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وحصاد الخلايا عن طريق هضم التربسين. أعد تعليق الخلايا الملصقة في 0.5 مل من وسط الاستزراع الطازج المكمل بميكروغرام واحد من أمين البولي إيثيلين وقم بإعداد PMVs كما هو موضح.

ثم قم بتركيز PMVs عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج مع دوامة لطيفة. بعد ذلك ، قم بتحميل الخلايا في حقنة أنسولين سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 30 وتطهير الجزء الخارجي من عضلة المعدة لفأر BALB / c المخدر بنسبة 75٪ من الإيثانول. ثم قم بحقن الحجم الكامل من PMVs ببطء في العضلات واسمح للحيوان بالتعافي تحت مصباح حراري.

بعد 12 ساعة ، رش 75٪ من الإيثانول على العضلات ، وافتح الجلد بالمقص ، وحصاد عضلة المعدة بأكملها من كلا الطرفين. شطف العضلات مع PBS ووضعها تحت المجهر الفلوري. باستخدام العدسة الموضوعية 20 مرة ، قم بإزالة قطع الأنسجة العضلية غير الفلورية بشفرة حلاقة حادة وقم بفرم القطع المتبقية ذات اللون الأحمر الشديد إلى حوالي تسعة مكعبات ملليمترات مكعبة.

قم بتضمين كل مكعب في وسط درجة حرارة القطع الأمثل. ثم اغمر المكعبات في النيتروجين السائل لمدة خمس دقائق. وتخزين عينات الأنسجة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليلها.

PMVs التي تم إنشاؤها من BMSCs كما هو موضح في الغالب حجما في حدود حوالي ثلاثة ميكرومتر في القطر كما تم فحصها تحت الفحص المجهري لتباين الطور باستخدام هدف 20 مرة. يوضح تعداء BMSC مع كاسيت التعبير الفلوري لمدة 48 ساعة التغليف السيتوبلازمي لبروتين EGFP بواسطة PMVs. علاوة على ذلك ، فإن الوقوف مع صبغة الميتوكوندريا الفلورية يكشف أن جزءا كبيرا من PMVs يحتوي على الميتوكوندريا.

معظمها إيجابي لصبغة محتملة لغشاء الميتوكوندريا ، مما يشير إلى وظيفة الميتوكوندريا. يمنع علاج أمين البولي إيثيلين قبل إعطائها في الجسم الحي تراكم PMV أثناء تركيز الطرد المركزي لإزالة المكونات الخلوية. يسهل وضع العلامات على الصبغة الغشائية ل BMSCs قبل توليد PMV توليد PMVs الفلورية القابلة للتتبع.

في الواقع ، يشير تصور الأجزاء المجمدة من عضلة المعدة بعد التوصيل العضلي ل PMVs المسمى المسمى إلى توصيل PMV إلى سيتوبلازم الخلية العضلية ربما عن طريق الالتقام الخلوي. عند محاولة إجراء إنشاء PMV ، من المهم أن تتذكر تحميل المحقنة بالعدد المناسب من الخلايا للضغط على المكبس بسرعة عند شطف الخلايا عبر الفلتر. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج بالخلايا الجذعية لاستكشاف علاج الأمراض المرتبطة بالعمر في الفئران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير PMV من BMSC لتوصيل السيتوبلازم إلى عضلة المعدة للفئران.