جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام N-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

الهدف العام من هذه التقنية هو توليد خلايا أو منتجات مشتقة من الخلايا مع تعبير حمض السياليك المعدل. لذلك ، تتم معالجة الخلايا باستخدام المانوزامين المعدل N-acyl والذي يتم استقلابه إلى أحماض السياليك المقابلة ويتم التعبير عنه لاحقا على سطح الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء السكرية ، مثل التأثير على الاقتران السكري على تفاعلات المستقبل والترابط.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة التطبيق وسامة للخلايا بحتة. لإثبات الهندسة السكرية الأيضية ، سنستخدم N-acetylmannosamine ، وهو متاح تجاريا. علاوة على ذلك ، سنوضح تخليق واستخدام N-propionyl و N-butanoylmanosamine.

يتم عرض التأثيرات البيولوجية لهندسة السكر الأيضية على التعبير عن حمض البوليسياليك. أولا ، قم بإذابة 431.2 ملليغرام من هيدروكلوريد مانوسامين في 10 ملليلتر من ثلاثة محلول ميثوكسيد الصوديوم المليمولار في زجاجة زجاجية سعة 15 مليلتر تحتوي على شريط تحريك. يبرد المزيج على الثلج إلى صفر درجة مئوية.

أثناء التحريك ، أضف ببطء 210 ميكرومتر من كلوريد البروبيونيل بالتنقيط إلى المحلول. ثم احتضن خليط التقليب عند صفر درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد ذلك ، انقل المحلول إلى أنبوب بلاستيكي سعة 50 مليلتر وأدخل أربعة إلى 8 ثقوب في غطاء الأنبوب بإبرة رفيعة.

قم بتجميد المحلول بسرعة باستخدام النيتروجين السائل. ثم قم بتجميد العينة حتى تجف تماما. بعد التجميد ، قم بإذابة المنتج المجفف في أسيتات الإيثيل والميثانول والماء.

باستخدام ماصة، قم بتحميل المحلول على عمود هلام السيليكا المعد مسبقا. بعد مسح 500 مل من المذيبات ، اجمع أربعة أجزاء مليلتر. انقل الكسور المملوءة إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 مليلتر ، وأدخل ثلاثة إلى ستة ثقوب في غطاء الأنبوب بإبرة رفيعة.

بعد تجميد المحلول بالنيتروجين السائل ، قم بتجميد العينة حتى تجف تماما. زراعة خلايا الورم الأرومي العصبي كيلي في وسط RPMI عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قبل تطبيق المانوزامين ، افصل خلايا الورم الأرومي العصبي كيلي عن طريق احتضانها لمدة 10 دقائق باستخدام التربسين و EDTA.

بعد تحييد التربسين بوسط RPMI ، عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer. لقياس السكريات الأحادية لحمض السياليك ، ضع الخلايا في 500 ميكرولتر من الوسط في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا. لتحليل الأحماض البوليزيالية ، ضع الخلايا في ثلاثة ملليلتر من الوسط على طبق ثقافة خلية قطره ستة سنتيمترات.

أضف مشتقات المانوسامين المعنية ، المذابة في RPMI ، إلى الخلايا المطلية حديثا ، بتركيز نهائي قدره خمسة ملليمولار وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لتحل محل الوسط الذي يحتوي على المانوزامين المعدل N-acyl كل 24 ساعة. بعد العلاج ، صب الوسط وغسل الخلايا باستخدام PBS. افصل الخلايا عن طريق احتضانها لمدة 10 دقائق باستخدام Trypsin و EDTA.

قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة نفس الحجم من وسط زراعة الخلايا إلى الخلايا المنفصلة. بعد ذلك ، انقل الخلايا المنفصلة إلى أنابيب بلاستيكية سعة 15 مل. الطرد المركزي للعينات لمدة ثلاث دقائق عند 500 مرة G.بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS.

بعد الطرد المركزي ، قم بإعادة تعليق كريات الخلايا المجمعة في 500 ميكرولتر من محلول تحلل HPLC البارد المثلج. الموجات فوق الصوتية العينات بإبرة معالج بالموجات فوق الصوتية ثلاث مرات لمدة 30 ثانية بسعات متوسطة إلى عالية ، وتبريد العينات على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل بين الدورات. بعد الطرد المركزي لعينات الخلايا المحللة ، افصل المادة الطافية عن كسور الغشاء في أنابيب بلاستيكية سعة 1.5 ملليلتر.

للتحلل المائي الحمضي ، أضف 150 ميكرولترا من محلول TFA مولي واحد إلى كسور الغشاء المنفصلة. احتضان العينات لمدة أربع ساعات عند 80 درجة مئوية مع الرج عند 200 إلى 600 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، انقل العينات إلى أنابيب ترشيح 0.5 مليلتر بثلاثة أغشية استبعاد كيلودالتون.

الطرد المركزي للعينات لمدة 30 دقيقة تقريبا عند 20،000 مرة جم و 21 درجة مئوية ، حتى يصبح حجم الطور العلوي أقل من 20 ميكرولترا. بعد ذلك ، تخلص من الإدخالات وأدخل فتحتين إلى أربعة ثقوب في أغطية الأنابيب التي تحتوي على الترشيح الفائق بإبرة رفيعة. بعد تجميد العينات بالنيتروجين السائل ، قم بتجميدها طوال الليل.

أعد تعليق العينات المجففة في 10 ميكرولتر من محلول TFA 120 مليمول، وأضف 50 ميكرولترا من محلول DMB. انقل العينات إلى أنابيب مظلمة سعة 1.5 مليلتر لحمايتها من الأشعة فوق البنفسجية. احتضان عينات ومعايير غشاء الخلية لمدة 1.5 ساعة عند 56 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، أضف أربعة ميكرولترات من محلول هيدروكسيد الصوديوم 400 مللي مولار إلى كل عينة لإيقاف تفاعل وضع العلامات. لتحليل HPLC ، اضبط درجة حرارة العمود على 40 درجة مئوية وقم بتكوين كاشف التألق على 373 نانومتر للإثارة ، و 448 نانومتر للإغفال ، على التوالي. قم بحقن 10 ميكرولتر من حجم العينة ، وافصل المجسات لمدة 15 دقيقة بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة باستخدام الميثانول والأسيتونيتريل والماء كمادة مشطحة.

لتحليل قياس الطيف الكتلي ، قم بحقن 20 ميكرولترا من كل عينة HPLC مجمعة في نظام كاشف انتقائي للكتلة LC. في برنامج التقييم لنظام الكشف الانتقائي للكتلة LC ، حدد ذروة الاهتمام في الكروماتوجرام الأيوني الكلي. عرض الطيف الكتلي للذروة التي تم حلها واعرض نسبة الكتلة إلى الشحنة الموجبة بين 300 و 700.

أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت لتحلل اللطخة الغربية إلى الكريات المعدة مسبقا للخلايا المهندسة بالجليكو والدوامة. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد ، مع دوامة كل خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 1.5 ساعة عند 20،000 مرة G وأربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على البروتينات من الخلايا المحللة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. قم بإعداد العينات لصفحة SDS عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لعينة Laemmli إلى 90 ميكرولتر من كل جزء من البروتين. اغلي العينات لمدة خمس دقائق.

بعد تحميل العينات على جل 8٪ SDS-acrylamide ، قم بتشغيل الجل على 25 مللي أمبير لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء ، قم بإزالة الغطاء الزجاجي بعناية من الجل واقطع الجزء العلوي من الجل الذي يحتوي على جيوب التحميل. بعد ذلك ، ضع الجل على غشاء 0.2 ميكرو نيتروسليلوز ، منقوع مسبقا في المخزن المؤقت للبقعة الغربية.

نقل البروتينات إلى النيتروسليلوز وفقا لتوصية النظام. بعد إزالة غشاء النيتروسليلوز من نظام النشاف ، قم بتلطيخ اللطخة باللون الأحمر Ponceau لتصور البروتينات وبالتالي التحكم في جودة النقل. ثم انقل غشاء النيتروسليلوز إلى غرفة بلاستيكية وأضف 10 مل من محلول الحظر.

بعد احتضان غشاء النيتروسليلوز ، قم بصب محلول المنع ، وأضف الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لحمض البوليسياليك 735 في PBS. بعد الحضانة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق باستخدام PBS. الآن ، أضف الجسم المضاد الثانوي IgG متعدد النسيلة المضاد للفأر إلى جانب بيروكسيداز الفجل الحار ، إلى غشاء النيتروسليلوز.

بعد احتضان الغشاء وغسله ، انقله إلى لوحة من جهاز تصوير مناسب. بعد ذلك ، اكتشف الإشارة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. DMB المسمى N-glycolyl نيوراميك حمض ، يميء ما بين سبع وتسع دقائق.

و DMB المسمى N-acetyl numaminic حمض الميلوء بين 10 و 12 دقيقة. تمثل العديد من القمم الأصغر التي لوحظت في الكروماتوجرام DMB غير متفاعل ووسيطات التفاعل. تظهر كروماتوغرامات HPLC لمحللات الخلية العديد من القمم غير المحددة ، والتي تمثل الشوائب الداخلية والمنتجات الثانوية DMB من التفاعل مع أحماض ألفا الكيتو الأخرى الموجودة في محللات الخلية.

غالبا ما يؤدي العلاج باستخدام N-acetyl Mannosamine إلى استنفاد حمض N-glycolylneuraminic على سطح الخلية. في الكروماتوغرامات للخلايا المحللة المعالجة بحمض N-propionyl neuraminic أو حمض N-butanoyl neuraminic ، لوحظت قمم تشير إلى ظهور أحماض السياليك غير الطبيعية المقابلة. يؤدي تفاعل DMB مع أنواع حمض السياليك إلى زيادة في الكتلة الجزيئية بمقدار 116.2 دالتون ، مقارنة بأنواع حمض السياليك التي لم يتم تصنيفها بهذه الصبغة.

إلى جانب أنواع الأيونات القوية ، لوحظت أيضا مقاربات الصوديوم. يتلاشى DMB-Neu5Gc بعد فترة وجيزة من أنواع DMB غير المتفاعلة أو المتفاعلة جزئيا ، وهو ما يفسر ظهور قمم غير محددة في الطيف الكتلي ل DMB-Neu5Gc. يؤدي علاج خلايا الورم الأرومي العصبي كيلي باستخدام N-propionylmannosamine أو N-butanoylmannosamine إلى تقليل التعبير عن حمض البوليسياتيك على سطح الخلية.

ناحية أخرى ، يؤدي العلاج باستخدام N-acetylmannosamine إلى زيادة التعبير عن حمض البوليزياتيك. من خلال تطبيق هذه التقنية ، يمكن إنشاء الخلايا ذات السياليلات المطلقة في غضون عدة أيام. يمكن استخدام هذه الخلايا المهندسة جليكو في مزيد من التجارب.

على سبيل المثال ، لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط أو كما هو موضح هنا ، لتثبيط التعبير عن حمض البوليزياتيك. تم تحسين إجراء هندسة التمثيل الغذائي المقدم هنا لتجارب حمض السياليك. ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس الإجراء أيضا في التجارب على.

نأمل أن يكون بروتوكولنا المقدم وإنتاج الفيديو هذا مفيدا للمؤلفين لجلب هندسة السكر الأيضية إلى المختبرات لتحليل الوظيفة وكذلك الدور البيولوجي لحمض السياليك ومستقبلات حمض السياليك في الأنظمة البيولوجية. يمكن للكيميائيين العضويين تصنيع المانوزامين المعدل N-acyl بهياكل أكثر تعقيدا واستخدامها على النحو المقترح في بروتوكولنا. باتباع بروتوكولنا ، يجب تحليل جميع العينات مباشرة بعد وضع العلامات الفلورية.

وبالتالي ، يجب ألا يكون هناك تأخير بين محللي HPLC و ACMS.