تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من ريبيسفالوس ميكروبلوس الخلايا الظهارية الظهارية

تنقية البروتين السطحي للخلية البيوتينيل من خلايا الأمعاء الظهارية Rhipicephalus microplus. ضمن هذه الدراسة ، تم استخدام منهجية معدلة قائمة على التدرج Percoll لعزل الخلايا الظهارية الفردية من أنسجة الأمعاء Rhipicephalus microplus. تم بيوتينيل البروتينات المرتبطة بالسطح وتنقيتها من خلال حبات الستربتافيدين المغناطيسية لاستخدامها في التطبيقات النهائية.

تشريح ظهارة الأمعاء من Rhipicephalus microplus شبه المحتقن. سوف تحتاج إلى المواد التالية. ألصق شريطا من الشريط اللاصق في قاع طبق بتري.

أضف قطرة من Super Glue إلى الشريط. ضع الجانب البطني للقراد لأسفل على Super Glue ، واتركه يجف. اغمر القراد تماما في 100 مل من PBS.

باستخدام مشرط مقاس 11 ، مقطوع من أعلى العينين إلى أسفل الإكليل على جانبي القراد. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة الدرع تماما والصفقة لفضح الأعضاء الداخلية. قم بإزالة الأعضاء البيضاء الدقيقة الشبيهة بالخيوط والأغشية الأخرى.

قم بإزالة القناة الهضمية باستخدام الملقط. قم بتخزين الأمعاء في HBSS و PIC المثلجة. تفكك الخلايا الظهارية.

سوف تحتاج إلى المواد التالية. صب القناة الهضمية المقطعة على مصفاة خلية 70 ميكرون داخل أنبوب فالكون سعة 50 مل. نظرا لأن الفراغ قد يتشكل داخل أنبوب فالكون ، ارفع الفلتر للسماح بتدوير الهواء.

اغسل أنسجة الأمعاء ب 50 مل HBSS المثلج مع الموافقة المسبقة عن علم. أعد تعليق الشجاعة في 30 مل HBSS المثلج مع الموافقة المسبقة عن علم. إذا لزم الأمر ، استخدم مكشطة معقمة للمساعدة في إعادة تعليق الأمعاء.

جهاز طرد مركزي بوزن 500 جم ، قم بإزالة المادة الطافية وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات. أعد تعليق خلايا الأمعاء في 10 مل من DMEM ، و 2٪ FCS ، و 5 مللي مولار EDTA ، و TCEP واحد مللي مولار و PIC.

تخلط بلطف. احتضن لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران بطيء باستخدام بكرة. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 250 ميكرون.

دوامة التدفق من خلال. وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون ، وجمع التدفق المتبقي من خلال. الطرد المركزي التعليق.

عزل الخلايا الظهارية المفردة باستخدام تدرج بيركول. سوف تحتاج إلى المواد التالية. من خلال التصفية من خلال ورق الترشيح المسبق AP15، قم بإعداد 40٪ و20٪ من Percoll في ماء Milli-Q.

قم بتحميل حقنة معقمة بمحلول Percoll. ضعه على جهاز الترشيح وقم بتفريغ Percoll ببطء. تبرد عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة قبل وضع طبقات التدرج.

قم بإعداد المضخة التمعجية كما هو موضح. باستخدام مضخة تمعجية مضبوطة بأقل سرعة ، ضع طبقة ثلاثة مل من 40٪ Percoll في أنبوب طرد مركزي فائق سعة 16 مل. اتركه يستقر على الجليد لمدة 15 دقيقة.

يجب أن تؤدي سرعة المضخة إلى معدل تدفق أقل من مل واحد في الدقيقة. قم بإمالة الأنبوب بزاوية 45 درجة ، استخدم المضخة التمعجية لطبقة 20٪ Percoll فوق طبقة 40٪. تأكد من أن أنبوب الإخراج يستقر على أنبوب الطرد المركزي لمنع اختلاط القطرات مع الطبقات السفلية.

يجب أن تؤدي سرعة المضخة إلى أقل من مل واحد في الدقيقة معدل التدفق. اترك الطبقات تستقر على الجليد لمدة 15 دقيقة. استخدام المضخة التمعجية بمعدل تدفق أقل من مل واحد في الدقيقة لطبقة ثلاثة مل من محلول DMEM الذي يحتوي على الخلايا الظهارية المعزولة على تدرج بيركول من 20 إلى 40٪.

تأكد من أن أنبوب الإخراج يستقر على أنبوب الطرد المركزي لمنع اختلاط القطرات مع الطبقات السفلية ، مما يؤدي إلى تعطيل التدرج. جهاز طرد مركزي بوزن 600 جم لمدة 10 دقائق. اجمع الأطوار البينية بين DMEM ، تدرج 20٪ Percoll ، وتدرجات 20٪ 40٪ Percoll لعزل الخلايا المفردة الظهارية.

بيوتينيل البروتين السطحي للخلية وعزل البروتينات السطحية الحيوية. سوف تحتاج إلى المواد التالية. بيوتينيلات 100 ميكرولتر من الخلايا الظهارية أحادية الخلية باستخدام مجموعة اقتران البيوتين من النوع A وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

أضف 100 ميكرولتر من PBS و 1٪ Triton X-100 و 10٪ جلسرين و 100 ميكرومولار من الجلوتاثيون المؤكسد و PIC إلى الخلايا الحيوية. احتضن على الثلج لمدة ساعة مع الخلط اللطيف كل 10 دقائق. الطرد المركزي مستخلص الخلية عند 20،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة واتركه جانبا.

تحضير 50 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغناطيسية عن طريق الغسيل ب 1,000 ميكرولتر من TBS 1٪ Tween-20. امزج برفق عن طريق النقر بإصبعك. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي ، واجمع الخرز على جانب الأنبوب.

قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. اجمع بين 300 ميكرولتر من بروتينات سطح الخلية الحيوية مع الخرز المغناطيسي المغسول. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض.

اجمع الخرزات بالحامل المغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. أضف 300 ميكرولتر من TBS 1٪ Tween-20 إلى الأنبوب ، واخلطه برفق لإعادة تعليق الخرز. اجمع الخرزات وقم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.

كرر خطوة الغسيل هذه مرتين. أضف 100 ميكرولتر من 1 مولار جلايسين الرقم الهيدروجيني اثنين إلى الخرز المغناطيسي. واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

اجمع الخرزات وقم بإزالة المواد الطافية التي تحتوي على بروتينات سطحية مملوثة بالبيوتينيل. الشكل الأول هو تمثيل للبروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الظهارية وبروتيناتها السطحية من القراد الكامل. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تنقية ما يقرب من 1.2 × 10 إلى سبع خلايا لكل مل مع 75 إلى 80٪ من الجدوى و 20 إلى 24 ميكروغراما من البروتينات السطحية المنقاة من 50 علامة.

تظهر الصور المجهرية الفلورية التمثيلية للقراد التي يتم إعدادها باستخدام هذا البروتوكول في الشكلين 2 أ و 2 ب. تظهر الخلايا على شكل مورفولوجيا سطحية مفردة وكروية وأملسة وحجم ثابت في جميع أنحاء العينة. يتم تصور العزلات الضعيفة لاحتواء تفكك غير كامل للخلايا الظهارية الفردية مع مجموعات خلايا مختلفة تم تحديدها من خلال أحجام الخلايا المختلفة والشكليات.

يمكن تقليل التلوث المتبادل من البروتينات المضيفة ، الشكل 3 أ ، عن طريق شطف أحشاء القراد بشكل كاف لإنتاج تدرج بيركول أبيض أو واضح ، الشكل 3 ب. مقارنة البروتينات بواسطة SDS-PAGE ، الشكل 4 أ ، البقعة الفضية ، الشكل 4 ب ، بقعة النقطة ، الشكل الخامس ، و ELISA ، الشكل السادس ، تشير إلى أن المنهجيات الموصوفة نجحت في تنقية البروتينات السطحية البيوتينيل من الخلايا الظهارية الفردية المعزولة من أحشاء القراد Rhipicephalus microplus. في الختام ، نجحت الطرق المستخدمة في هذه الدراسة في عزل الخلايا الظهارية الفردية من الأمعاء بأكملها ل Rhipicephalus microplus.

تم الحصول على بروتينات من سطح الخلايا الظهارية Rhipicephalus microplus لمزيد من التحليل والدراسات. أخيرا ، أظهر البروتوكول الذي تم تطويره العائد المحتمل للخلايا الظهارية الفردية من أمعاء القراد وكفاءة البروتينات السطحية البيوتينيل للخلية. يمكن استخدام البروتوكول الذي تم تطويره في أي نوع من أنواع القراد ذات الأهمية الاقتصادية في محاولة للتحقيق في تفاعلات القراد والمضيف من خلال دراسة تكوين البروتين الغشائي في الأمعاء.