كشف "يغاندس إستروجين" في "منتجات العناية الشخصية" استخدام "الإستروجين الخميرة الشاشة الأمثل" "المختبر التدريس الجامعي"

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام فحص الإستروجين بالخميرة لتقدير كمية محفزات مستقبلات الإستروجين البشرية المستخلصة من منتجات العناية الشخصية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات علم السموم، واضطرابات الغدد الصماء، والفيزيولوجيا البيئية، لأنها تكتشف وتقيس كمية الإستروجينات البيئية في المياه والأغذية ومنتجات العناية الشخصية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية المختبرية في أنها غير مكلفة وشائعة الاستخدام، وتوفر منصة ممتازة لتدريس المهارات المختبرية التقنية.

يُعد الكشف عن الاستروجينات البيئية أمراً بالغ الأهمية لأنها يمكن أن تغير الإشارات الهرمونية، لا سيما أثناء التطور الجنيني وفترات الانتقال الفسيولوجي مثل مرحلة البلوغ. وتتمثل الأجزاء الأكثر صعوبة في هذه الطريقة في الحسابات وتحليل البيانات، والتي قمنا بتبسيطها من خلال تطوير تطبيق سهل الاستخدام. كما أن الدقة في عملية السحب بالماصة أمر أساسي.

يبدأ هذا البروتوكول بتحضير الكواشف. قم بتحضير أوساط الجلوكوز والجالاكتوز، وعينات الضبط الناقلة المكونة من 50%ethanol، ومعايير الإستراديول التي ستُستخدم في اليوم الأول من المقايسة، بالإضافة إلى محلول LacZ المنظم، والديثيوثريتول، وكربونات الصوديوم لليوم الثاني. قم بتعقيم أوساط الجلوكوز والجالاكتوز عن طريق الترشيح باستخدام مرشح بمسامية 0.2 micrometer.

يمكن اختبار ما يصل إلى 23 منتجاً مختلفاً من منتجات العناية الشخصية (PCPs) وعناصر ضبط الاستخلاص في ثلاث مكررات على لوحة واحدة ذات 96 بئراً. تشمل منتجات العناية الشخصية الصابون، وكريم الشعر، والشامبو، وواقي الشمس، والمكياج، وكريم الحلاقة، واللوشن. ولأغراض التصوير، سيتم تحضير عينات من ثمانية منتجات فقط من منتجات العناية الشخصية.

اجمع جراماً واحداً من كل عينة مع 10 milliliters من الإيثانول اللامائي في أنبوب مخروطي سعة 15-milliliter. بالإضافة إلى ذلك، قم بتجهيز ضابط استخلاص سلبي يتكون من 11 milliliters من الإيثانول اللامائي في أنبوب مخروطي سعة 15-milliliter. قم بتجانس محتويات كل أنبوب مخروطي لمدة 30 دقيقة عن طريق الجمع بين الرج اليدوي واستخدام جهاز vortexting.

قم بطرد الأنابيب المخروطية مركزياً بأقصى سرعة مسموح بها في جهاز طرد مركزي ذي سلال لمدة 10 دقائق. صب السائل الطافي من كل أنبوب من خلال مصفاة خلايا بقطر 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. بعد ذلك، انقل محتويات كل أنبوب سعة 50 ملليلتر إلى قارورة وميض زجاجية.

اترك الإيثانول يتبخر تماماً بترك القوارير مفتوحة في غطاء سحب مجهز بالتهوية لمدة أسبوع واحد. احمِ العينات التي يتم تجفيفها من الضوء لتجنب تحلل المكونات الحساسة للضوء. وعندما تجف العينات، أعد تشكيل كل عينة في 1 milliliter من إيثانول بتركيز 50% ثم استخدم جهاز vortex للمجانسة.

قبل ليلتين أو بنحو 42 ساعة من تحضير أطباق فحص الإستروجين في الخميرة (YES)، استخدم تقنية التعقيم لاستزراع الخميرة فرعياً عن طريق إضافة 0.1 milliliters من كل مستنبت خميرة نشط إلى 10 milliliters من وسط الجلوكوز المعقم بالترشيح في دورق إرلنماير معقم. يتم التحضين عند 30 degrees Celsius مع الاستمرار في تحضين المستنبتات الأصلية كمخزونات. بعد يومين، في اليوم الأول من مقايسة YES، استخدم تقنية التعقيم لتخفيف مستنبتات الخميرة المعلقة ووسط الجالاكتوز المعقم بالترشيح في بيكر معقم.

قم بتأكيد الكثافة الضوئية عن طريق سحب 120 µL من كل عينة خميرة في ثلاث مكررات، بالإضافة إلى ثلاث مكررات من عينات فارغة (blanks) من وسط الجالاكتوز، ووضعها في طبق بوليسترين شفاف. استخدم جهاز قياس الطيف الضوئي للأطباق للتحقق من أن مزرعة الخميرة المخففة لها كثافة ضوئية صافية تبلغ 0.065 ± 0.005 عند طول موجي قدره 610 nm. يتم تحديد قيمة OD610 الصافية للخميرة بطرح قيمة OD610 الخاصة بالعينات الفارغة من وسط الجالاكتوز.

باستخدام ماصة تكرارية ذات رأس حقنة معقم، أضف معلق الخميرة المخفف إلى آبار لوحة ميكروية من البولي بروبيلين مكونة من 96 بئراً ومعقمة، وذلك وفقاً لمخطط اللوحة الموضح. أثناء عملية pipetting، حافظ على بقاء الخميرة المصدرية معلقة عن طريق تحريك الكأس باستمرار أو الخلط باستخدام الماصة. وأخيراً، أضف 120 µL من وسط الجالاكتوز المعقم بالترشيح إلى الآبار من H10 إلى H12، والمشار إليها باللون الأخضر في مخطط اللوحة، لتعمل كضوابط للوسط من أجل حساب الامتصاصية الناتجة عن الوسط وحده.

قم بتجهيز أطباق منفصلة لكل مجموعة من سلالة الخميرة والركيزة القياسية اللونية التي سيتم اختبارها. بعد ذلك، قم بإنشاء منحنى قياسي في كل طبق عن طريق التخفيف التسلسلي وفقاً لمخطط الطبق. استخدم ماصة أحادية القناة مع رؤوس معقمة لإضافة 5 µL من معيار الإستراديول إلى الآبار A1 وA2 وA3. استخدم ماصة متعددة القنوات لمزج محتويات الآبار عن طريق السحب والضخ، ثم انقل 205 µL من الآبار A1 إلى A3 إلى الآبار B1 إلى B3. كرر عملية نقل 205 µL عبر الصف G. بعد اكتمال التخفيف التسلسلي، تخلص من 205 µL من الآبار G1 إلى G3. في نهاية هذه الخطوة، يجب أن تحتوي جميع آبار المعايير على 120 µL.

أضف 5 µL من الإيثانول بتركيز 50% إلى كل بئر من آبار ضابطة المركبة التي تحتوي على معلق الخميرة، وهي الآبار H1 وH2 وH3، الموضحة باللون الأزرق في مخطط الطبق هذا. الخطوة التالية هي إضافة ثلاث مكررات بحجم 5 µL من العينات أو ضوابط الاستخلاص السلبية إلى الآبار التي تحتوي على معلق الخميرة، والموضحة باللون الأرجواني في مخطط الطبق. دوّن العينات أو ضوابط الاستخلاص التي تم وضعها في كل بئر.

لتتبع الآبار التي تحتوي على عينات وتلك التي لا تحتوي، ابدأ بصندوق رؤوس ماصات جديد واستخدم الرؤوس من نفس مواقعها في الصندوق والتي تطابق مواقع الآبار المقابلة في الطبق. امزج محتويات آبار العينة، وضابط الاستخلاص، وضابط الناقل عن طريق الماصة. اضبط أحجام هذه الآبار لتصبح 120 microliters عن طريق إزالة 205 microliters من كل بئر.

قم بإغلاق كل طبق بغشاء مسامي لاصق ومعقم، ثم ضع علامة تعريفية، واحضن الأطباق عند 30 degrees Celsius لمدة 17 ساعة. بعد فترة الحضانة التي استمرت 17 ساعة، قم بإخراج الأطباق من الحاضنة. في حال تعذر معالجة الأطباق على الفور، قم بلفها بغلاف بلاستيكي واحفظ الأطباق الملفوفة في الثلاجة عند four degrees Celsius لمدة ستة أيام.

عندما تكون جاهزاً لمعالجة الأطباق، قم بفك تغليفها. استخدم ماصة متعددة القنوات لخلط محتويات كل صف من الآبار، ثم انقل 50 µL من معلق الخميرة من كل بئر إلى البئر المقابل في طبق ميكروي من البوليسترين الشفاف يحتوي على 96 بئراً. قم بوضع علامة تعريفية على الطبق الجديد.

لتجنب التلوث الخلطي بين الآبار، استخدم رؤوس ماصات جديدة لكل بئر، ولكن لا يشترط أن تكون هذه الرؤوس معقمة. داخل خزانة استخلاص الغازات، أضف 20 µL من DTT بتركيز 1 M إلى 20 mL من منظم LacZ المذاب في درجة حرارة الغرفة، للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 mM من DTT. اخلط منظم LacZ جيداً.

باستخدام ماصة مكررة، أضف 200 µL من منظم LacZ المحتوي على DTT وإما ONPG أو CPRG إلى جميع آبار لوح البوليسترين، وقم فوراً بقياس وتسجيل الكثافة الضوئية عند 610 nm لجميع الآبار باستخدام قارئ الألواح. كرر العملية حسب الحاجة للألواح الإضافية. غطِّ الألواح بغطاء وقم بتحضينها عند 30 °C للمدد الزمنية المحددة.

عند اكتمال فترة التحضين، أخرج الأطباق من المحضن. استخدم ماصة تكرارية لإضافة 100 µL من كربونات الصوديوم إلى كل بئر لوقف تفاعل беta-galactosidase. قم بقياس وتسجيل الكثافة الضوئية عند 405 nm لـ ONPG أو 574 nm لـ CPRG لجميع الآبار باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأطباق.

يمكن إجراء حساب قيم LacZ باستخدام تطبيق مؤتمت يتطلب تثبيت برنامج Java. للبدء، افتح تطبيق LacZ المؤتمت الموضح في الملحق رقم واحد. قم بلصق قراءات الكثافة الضوئية عند 405 نانومتر لـ ONPG أو 574 نانومتر لـ CPRG لجميع الآبار باستخدام تخطيط صفيحة مطابق لما هو موضح في الشكل رقم واحد.

أدخل مدة فترة الحضانة وعدد الساعات اللازمة للمقايسة لإنتاج اللون ثم انقر فوق "التالي". قم بلصق قراءات الكثافة الضوئية عند 610 نانومتر لجميع الآبار. انقر فوق "إرسال" لعرض نتائج LacZ.

يمكن نسخ نتائج LacZ باستخدام أوامر لوحة المفاتيح ولصقها في جدول بيانات أو ملفات أخرى حسب الحاجة. ابدأ هذا التحليل بفتح تطبيق تحليل بيانات مقايسة YES المتاح عبر الإنترنت. قم بتحميل ملف بيانات بصيغة CSV منسقاً كما هو موضح في علامة التبويب الأولى.

قم برقمنة منحنى الاستجابة القياسي للإستراديول في علامة التبويب الثانية وقم بتقدير معاملات الانحدار. اطلع على مخرجات نموذج الانحدار في علامة التبويب الثالثة، ثم ابحث عن قيم محور x المستنبطة التي تقابل قيم LacZ للعينات في علامة التبويب الرابعة. انقر فوق علامة التبويب الخامسة لرؤية مكافئ الإستروجين أو قيم EEQ للعينات.

أخيرًا، قم بتوحيد قيم EEQ بالنسبة لكتلة العينة الأصلية كما هو موضح في البروتوكول النصي. تظهر هنا أمثلة على منحنيات القياس بعد تحضين الخميرة مع 17 beta-estradiol لمدة 17 ساعة. وللأسباب المذكورة في المخطوطة، غالبًا ما يكون CPRG خيارًا أفضل كركيزة من ONPG.

وتماشياً مع الملاحظات السابقة، كانت المقايسات التي استخدمت خميرة تعبر عن ER Beta أكثر حساسية بأكثر من ترتيب مقداره عشر مرات مقارنة بالمقايسات التي استخدمت خميرة تعبر عن ER Alpha. وبناءً على ذلك، تم الكشف عن النشاط الإستروجيني بشكل متكرر أكثر باستخدام الخميرة المعبرة عن ER Beta. كما تمثّل هدف إضافي للدراسة في اختبار فترات حضانة تكون متوافقة مع الجدول الزمني للدورة المختبرية لطلاب المرحلة الجامعية.

عند إدخال فترة تبريد لمدة ستة أيام بعد فترة الحضن التي استمرت 17 ساعة، كانت المنحنيات القياسية للأطباق المبردة قابلة للمقارنة مع تلك الخاصة بالأطباق غير المبردة. وكانت الأخطاء المعيارية للمعاملات التي تم تقديرها باستخدام نماذج الانحدار اللوجستي رباعية المعاملات جميعها أصغر في الأطباق المبردة مقارنة بالأطباق غير المبردة. وبالتالي، فإن تبريد الأطباق لمدة ستة أيام يقلل من الخطأ ويحسن دقة تقديرات EEQ.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في جلستين تستغرق كل منهما من ثلاث إلى أربع ساعات. وأثناء تنفيذ الإجراء، من المهم تذكر تطبيق التقنية المعقمة في جميع الخطوات التي تسبق فترة الحضانة التي تستمر لـ 17 ساعة، والحرص على السحب والتقطير بدقة وعناية، واتباع مخطط توزيع الأطباق الموضح في الشكل 1. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المقايسات الحيوانية في الجسم الحي (in-vivo) لاستقصاء آليات إضافية للعمل الإستروجيني وتأثيراتها على الكائن الحي بأكمله.

بعد تطويره، أصبح اختبار فحص الإستروجين بالخميرة مقبولاً كتدبير منخفض التكلفة لقياس الروابط الإستروجينية في العينات البيئية مثل الأطعمة، والأنسجة النباتية، ومنتجات العناية الشخصية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء استخلاصات بسيطة لمنتجات العناية الشخصية، وزراعة الخميرة، وإعداد منحنيات التخفيف القياسية، وتشغيل مقايسة YES في طبق ذو 96 بئراً، وإكمال الحسابات المرتبطة بها. ولا تنسَ أن العمل مع estradiol يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعدات الوقاية الشخصية الأخرى، بالإضافة إلى ضمان التخلص المناسب منه عند تنفيذ هذا الإجراء.