في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو تحفيز ومراقبة تحريض عضلة القلب للخلايا الجذعية الوسيطة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية الوسيطة مثل العلاجات التي يمكن أن تحفزها الإشارات البيئية لتوليد خلايا عضلة القلب الوظيفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تطبق التكوين الكلي وطبقات الجنين القلبية ، بدلا من العوامل الدوائية أو المواد الوراثية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج أمراض القلب والأوعية الدموية لأنها توضح بالتفصيل إمكانات عضلة القلب للخلايا الجذعية الوسيطة. وستكون الآنسة فروة إقبال، طالبة الدكتوراه في مختبرنا، وماكس ليبراخ وناداف جاسنر، وكلاهما متدربان في مختبرنا. بعد عزل أجزاء جرو الفئران وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع البطينين إلى نصفين ونقلهما إلى طبق طوله 10 سم مع 10 مل من PBS وشريط على الجليد ، للسماح للدم بالغسل.

ثم باستخدام مقص منحني ، قم بقطع جدران البطين إلى قطع صغيرة بقطر من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات. باستخدام ماصة مصلية ، انقل قطع القلب من 10 إلى 12 إلى أنبوب سعة 50 مليلتر واتركها تستقر. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS P / S ، دون إزالة أي قطع قلب.

ثم أضف 10 ملليمترات من PBS P / S الطازج. لعزل خلايا عضلة القلب ، بعد أن تستقر قطع القلب ، استخدم 0.15٪ تريبسين في PBS ، لاستبدال PBS P / S واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية.

بعد ذلك ، كرر هضم التربسين ثلاث مرات أخرى ، باستثناء المواد الطافية في أنابيب تجميع سعة 50 مليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من FBS بنسبة 100٪. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنابيب الخلايا وشفط المادة الطافية. ثم استخدم DMEM-F12 مع 10٪ FBS و 1٪ P / S لإعادة تعليق الخلايا وبذرها في صفيحة من ستة آبار.

بمجرد أن تلتصق الخلايا ، استبدل الوسط بملليلترين من الوسط الطازج. لتحضير الخلايا الجذعية الجذعية الملطخة مسبقا ، قم بإزالة الوسط من مزارع MSC التي وصلت إلى 70٪ إلى 80٪ من التقاء في أطباق 10 سم وأضف ثلاثة ملليلتر من محلول تفكك الخلايا. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق.

انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة خمس دقائق. استنشق المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية وإعادة تعليق الخلايا. ثم استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا.

تمييع الخلايا إلى تركيز 1 × 10 إلى سادس MSCs لكل مليلتر ، في DMEM-F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S. بعد ذلك ، إلى الخلايا الموجودة في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مليلتر ، أضف صبغة فلورية قابلة للحياة وغير قابلة للتحويل واحتضان الخلايا الجذعية الجذعية لمدة نصف ساعة. بعد الطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة خمس دقائق ، قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بتركيز 1 × 10 إلى سادس MSCs لكل مليلتر.

ثم انقل الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا عضلة القلب بتركيز 10 × 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر من صفيحة الآبار الستة. لعمل الثقافات المشتركة المجمعة ، قم بإعداد معلق خلية واحدة من الخلايا الجذعية الجذعية في ألفا MEM ، مكملا بنسبة 10٪ FBS و 1٪ P / S. ابدأ التكوين الكلي ، عن طريق وضع 25 قطرة ميكرولتر من تعليق الخلية على السطح الداخلي لأغطية أطباق زراعة الأنسجة 10 سنتيمترات.

ضع الأغطية على نظيراتها السفلية التي تحتوي على PBS P / S. احتضن الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تحت مجهر ستيريو ، لاحظ التكوين الكلي في القطرات بعد ثلاثة أيام.

إذا كان أكثر من 80٪ من القطرات تحتوي على مجاميع مشكلة ، فاستخدم ماصة دقيقة سعة مليلتر واحد لجمع القطرات من الأغطية ونقل الركام مباشرة إلى طبقات أحادية خلايا عضلة القلب الأولية للفئران. احتضان الثقافات المشتركة الإجمالية لمدة تصل إلى أسبوعين. تغيير الحجم الكامل للوسيط كل 72 ساعة.

على أساس يومي ، استخدم الفحص المجهري للمجال الساطع لمراقبة الركام الملتصق بطبقات الخلايا الجنينية. سجل مجاميع التعاقد عند ملاحظتها. تتعاقد المجاميع النشطة بطريقة متزامنة ، نقترح موصلية بينهما في جميع أنحاء طبقة الجنين ، والتي ليس لها نشاط بدني.

استنشق الوسط وأضف ملليلترين من PBS لكل بئر من طبق الآبار الستة. ثم قم بإزالة PBS وأضف ملليلترين من محلول التفكك لكل بئر. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث دقائق.

كما هو موضح هنا ، أظهرت HMSCs من ثلاثة أنواع مختلفة وفرة ومظهر متشابهين في الثقافات المشتركة المباشرة. بعد يومين إلى ثلاثة أيام من نقل القطرات المعلقة على خلايا القلب في الثقافات المشتركة المجمعة ، ظهرت FTMs و PBCs المصطلحات في مجاميع أكبر مقارنة بتلك التي شوهدت من BMSCs. في هذه التجربة ، أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير CD49F في الخلايا الجذعية الجذعية غير المتمايزة أن 96٪ من PBCs للهيكل FTM ، والتي تسمى 89٪ من PBCs و 53٪ من BMSCs ، كانت إيجابية لسطح الخلية CD49F.

فاز قياس التدفق الخلوي على TRA ب 85 خلية ، وأظهر تنظيم العلامة المرتبطة بخلايا عضلة القلب ، SIRPA في FTM huck PBCs ومصطلح PBCs ، ولكن ليس في BMSCs من الثقافات المشتركة لخلايا عضلة القلب المباشرة. كما هو موضح هنا ، كان تنظيم cx43 أعلى بكثير في PBCs للهيكل FTM مقارنة بمصطلح PBCs أو BMSCs في الثقافات المشتركة المباشرة. كشف تحليل المجهر الفلوري أن التفريق بين FTM و Huck PBCs ، وكلاهما منظم cx43.

مع مصطلح Huck PBCs في جزء أعلى من FTMs. ومع ذلك ، كشف الفحص المجهري الفلوري أنه لوحظ النقط الإيجابي cx43 في غشاء الخلية ل FTM huck PBCs وكانت في الغالب سيتوبلازمية في الخلايا النهاية. أخيرا ، كما هو موضح هنا ، تم إجراء الفحص المجهري الفلوري عالي التكبير على الخلايا البشرية التي تم فرزها ، بعد الزراعة المشتركة وتأكيد الوفرة العالية ل cx43 في غشاء البلازما.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في ساعة واحدة لكل منها ، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على الاحتياطات المعقمة. الأنسجة الحيوانية الأولية المعنية والتي قد تسبب التلوث ، إذا لم يتم التعامل معها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل زيادة زراعة المجاميع المقاولة للإجابة على أسئلة إضافية مثل طول عمر هذه الهياكل. بعد تطويرها ، تمكن هذه التقنية الباحثين في مجال الخلايا الجذعية الوسيطة من استكشاف إمكانات التمايز للمصادر الأصغر سنا للخلايا الجذعية الوسيطة مثل الأنسجة الجنينية الإضافية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مجاميع MSC ودمجها مع طبقات الجنين الأنسجة الأولية المباشرة ، بطريقة توفر تحريضا مناسبا لتمايز عضلة القلب.

لا تنس أن العمل مع BRDU يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التعامل السليم مع النفايات السامة للخلايا أثناء تنفيذ هذا الإجراء.