تقنيات المختبر تستخدم للحفاظ على والتمايز بيوتيبس ضمة الكوليرا العوازل السريرية والبيئية

الهدف العام من هذه التقنية هو توفير مجموعة من البروتوكولات التي يسهل تنفيذها ويمكن أن تساعد أي محقق على توصيف عزلة سريرية أو بيئية معينة من ضمة الكوليرا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجراثيم مثل الخصائص الجينية والنمطية المحددة لأي عزلة ضمة الكوليرا ، خاصة تلك ذات الصلة السريرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لأي محقق باستخدام هذه المجموعة من المقايسات لتوصيف وتمييز عزلات ضمة الكوليرا السريرية أو البيئية بشكل موثوق.

هذه المقايسات معا نهجا منهجيا لاستخدامه كبديل أو بالإضافة إلى التجارب كثيفة العمالة المكلفة وتوصيف العزلات السريرية والبيئية لضمة الكوليرا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على توصيف الأنماط الحيوية للضمة الكوليرا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا لتوصيف القدرات الكيميائية الحيوية والتمثيل الغذائي للبكتيريا المعوية الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من إدارة الوقت لأن أوقات الحضانة اللازمة لضمان اختلاف النتائج المثلى بين المقايسات الكيميائية الحيوية.

العروض المرئية لبروتوكولات الاكتشاف والطعن أمرا بالغ الأهمية حيث يمكن أن يؤدي التناثر في كثير من الأحيان إلى التلوث المتبادل ويلزم الحد الأقصى للتباعد لمنع الاندماج بين الثقافات. ابدأ البروتوكول عن طريق تكوير 1.8 مل من المزرعة السائلة طوال الليل لمدة دقيقتين عن طريق الطرد المركزي بحد أدنى 8,600 xG في أنبوب معقم للطرد المركزي 2 مل. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 900 مللي لتر من مرق Luria-Bertani أو LB الطازج عن طريق سحب العينات.

بعد ذلك ، أضف 900 مل لتر من الجلسرين المعقم بنسبة 60٪ من الحجم إلى الحجم إلى المزرعة واخلطه عن طريق الدوامة. انقل الخليط إلى أنبوب مبرد معقم سعة 2 مل وقم بتخزين مزرعة المرق على حرارة 80 درجة مئوية. لاستخدام المخزون ، مع حلقة تلقيح معقمة ، قم بإزالة كمية صغيرة من المخزون المجمد وخط البكتيريا للحصول على مستعمرات مفردة على ألواح LB أجار.

أعد المرق المجمد على الفور إلى 80 درجة مئوية بعد الاستخدام لمنع المزارع من الذوبان تماما. احتضن جانب الغطاء لأسفل لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية. احصل على لوحة معدة مسبقا.

4 مل من مرق LB السائل في أنبوب استزراع معقم سعة 10 مل مع مستعمرة واحدة عن طريق لمس سطح المستعمرة الفردية بحلقة معقمة ونقل المستعمرة إلى المرق السائل. بعد ذلك ، احتضان المزرعة بالتهوية في حاضنة شاكر عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية. تحضير المزرعة بين عشية وضحاها في مرق LB السائل.

في اليوم التالي ، قم بتكسير المزرعة واغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق حبيبات الخلية في 1.8 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x أو PBS. كرر إجراء الغسيل ثلاث مرات. اتبع الغسيل الثالث بإعادة تعليق نهائية في 1.8 مل من 1x PBS.

بعد ذلك، استخدم طرف ماصة لاكتشاف 1 مل لتر من المزرعة المغسولة على الوسط المعني. اغسل حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها من الثقافة الليلية. قم بتلقيح ألواح أجار الحركة عن طريق إدخال طعنة تلقيح في مزرعة السائل المغسول وطعنها عموديا في الوسائط.

تأكد من أن طعنة التلقيح لا تنحني أثناء طعن الأجار. بين كل تلقيح ، قم بتعقيم طعنة السلك باستخدام موقد بنسن. احتضن جانب غطاء الألواح لأعلى لمدة 14-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد 14 ساعة ، راقب لوحات الحركة عن كثب لمنع فرط نمو الثقابات. تلقيح 4 مل من مرق ميثيل ريد فوجس-بروسكوير أو مرق MR-VP عن طريق سحب 10 مللي لتر من المزرعة الليلية المعدة مسبقا في 4 مل من مرق MR-VP في أنبوب استزراع معقم واحتضانه بالتهوية في حاضنة شاكر عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 150 مللي لتر من وزن 5٪ لكل حجم من ألفا نافثول و 50 مللي لتر من 40٪ من الوزن لكل حجم هيدروكسيد البوتاسيوم إلى 1 مل من مزرعة MR-VP الليلية في أنابيب الاستزراع المعقمة على التوالي.

ثم ، دوامة الأنابيب لفترة وجيزة. اترك الأنابيب تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أربع ساعات حتى يتطور تغير اللون. تم تضمين السلالات المرجعية للنمط الحيوي ومتغيرات El Tor التمثيلية في الشاشات الجينية الأساسية PCR وفحوصات النمط الظاهري للتمييز بين خلفيات النمط الحيوي للعزلات السريرية والبيئية V.Cholerae.

أظهر O395 الكلاسيكي من النوع البري تسلسلات ctxB و tcpA الكلاسيكية. على العكس من ذلك ، أظهرت سلالات El Tor من النوع البري N16961 و C6706 تسلسل El Tor ctxB و tcpA. يحتوي MQ1795 و BAA-2163 على الوحدة الفرعية للنمط الحيوي الكلاسيكي ctxB المماثلة ل 0395.

ومع ذلك ، احتوى كلا النوعين من El Tor على tcpA الذي يدل على خلفية النمط الحيوي ل El Tor. عندما نمت على ألواح أجار LB المكملة بالبوليميكسين B ، أظهرت سلالة النمط الحيوي الكلاسيكي من النوع البري 0395 حساسية للبوليميكسين B بينما أظهرت سلالة النمط الحيوي من النوع البري El Tor مقاومة. أظهرت سلالات El Tor التمثيلية مقاومة مماثلة للمضاد الحيوي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بين الأنماط الحيوية ل ضمة الكوليرا باستخدام نظام تحديد الفحص المتعدد الموضح في هذه المخطوطة. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض BSL-2 يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب فرض المناولة السليمة والتخلص من جميع المواد والنفايات وفقا للوائح المؤسسية والمحلية والولائية والفيدرالية. بالإضافة إلى البروتوكولات المدرجة في هذه المخطوطة ، يمكن تحقيق مزيد من التوصيف لعزلات ضمة الكوليرا من خلال التحقيق في خصائص النمط الظاهري الأخرى مثل تكوين الأغشية الحيوية والتجور الذاتي.