نظام متكامل لتشغيل عن بعد توصيل الإشارة داخل الخلايا بوساطة نانوحبيبات Upconversion كيناز فوتواكتيفيشن

الهدف من هذه التجربة هو إثبات جدوى تنشيط الإنزيم الضوئي باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة. يتم تثبيت كيناز البروتين المغلق A على هذا السطح من الجسيمات النانوية المحقونة بالتحويل الجزئي في الخلايا ولوحظت الاستجابة المستحثة عن كيناز في الخلايا الحية بعد الأشعة تحت الحمراء القريبة. يتطلب التنشيط الضوئي التقليدي ضوء الأشعة فوق البنفسجية السامة للضوء ، وسيؤدي حتما إلى تفاعل كيميائي غير مرغوب فيه واستجابة مماثلة ، ومع ذلك ، في خياراتنا الودية ، مثل الأشعة تحت الحمراء القريبة ، لا يمكن أن يؤدي إلى تفاعل بسبب طاقته المنخفضة.

يمكن للجسيمات النانوية ذات التحويل الصاعد تحويل الطاقة المنخفضة الصديقة للبيئة بالقرب من فوتون الأشعة تحت الحمراء إلى فوتون الأشعة فوق البنفسجية عالي الطاقة لتحفيز تفاعل كيميائي بالقرب من سطح الجسيمات دون إشعاع مباشر للأشعة فوق البنفسجية. يلعب Kinase دورا رئيسيا في تكوين الأورام ، ويمكن أن تساعدنا هذه التقنية في فحص المزيد من معلومات نقل الإشارة مع ضوضاء تداخل أقل بكثير من السمية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية ورد فعلها الجانبي. بشكل عام ، سيواجه الأفراد الجدد في هذا المجال صعوبات في تعديل الأدوات والإعداد البصري لتطبيق التحويل.

للبدء ، قم بتثبيت عدسة موضوعية 4x بجوار حامل الكوفيت لمقياس الطيف الفلوري ، بحيث يمكن تركيز الليزر في منتصف الكوفيت. ضع ليزر قابل للضبط 980 نانومتر 90 درجة مقابل العدسة الشيئية. قم بتركيب مرآة انعكاس كاملة وتقاطع مسار الضوء للعدسة الموضوعية والليزر.

لا تنس وضع صفيحة معدنية مؤكسدة لسد نافذة الإثارة لمقياس الطيف لحماية الأجزاء الداخلية. ثم ضع كوفيت من محلول الجسيمات النانوية المطلي بالسيليكا في الحامل. يمكن تصور شعاع التحويل الساطع عند تشغيل الليزر.

قم بتبديل التحليل الطيفي إلى وضع اللمعان ، مع أقل جهد PMT أثناء المحاذاة. اضبط مرآة ومراحل الليزر بحيث يكون الشعاع عبر منتصف الكوفيت حتى يلتقط PMT أقوى إشارة. بعد تثبيت مرآة ثنائية اللون ومرشح إثارة ، قم بتثبيت صمام ثنائي ليزر 980 نانومتر في مسار ضوء الطبقة السفلية.

أضف موازيا بين الليزر والمرآة للمساعدة في نشر وتكبير منطقة تشعيع الأشعة تحت الحمراء في المستوى البؤري. ثم استخدم محلول الجسيمات النانوية لتصور شعاع الأشعة تحت الحمراء القريبة. اضبط موضع مرحلة الليزر لتوسيط شعاع ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة لإنهاء المحاذاة.

قم بإجراء توليف PKA المحبوس وتسريح PKA / UCNP المحبوس ، لإنشاء PKA / UCNP المحبوس كما هو موضح في بروتوكول النص. لقياس نشاط كلا البنيين قبل التحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية ، قم بقياس الانخفاض في المواد الماصة NADH في خليط الفحص بمرور الوقت بعد إضافة ميكرولترين من محلول PKA إلى خليط المقايسة. كرر القياس ل PKA/UCNP.

بعد ذلك ، قم بإجراء التحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 200 مللي واط لكل سنتيمتر مربع من PKA المحبوس و PKA / UCNP ، في حمام ماء مثلج ، للتأكد من إمكانية تنشيط PKA. يتم تحديد نشاط PKA عن طريق الفحص المقترن بإنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات بيروفات كيناز. مع انخفاض في المواد الماصة NADH ، يتم قياسها بمرور الوقت بعد إضافة محلول PKA.

احتضان الخلايا في مصل بقري جنين 10٪ يحتوي على وسط L15 خلال فترة الحقن المجهري للتحكم المستقر في درجة الحموضة خارج الحاضنة. قم بتكوين مجتذب الإبرة لطرف مخروطي الشكل يبلغ قطره حوالي 1.5 ميكرون لفتح الطرف لاحقا. لفتح الطرف ، قم بتثبيت الإبرة على الحاقن الدقيق وحرك طرف الإبرة الملامسة لحافة الشريحة واتبعها بمقبض خفيف على مرحلة المجهر.

قوة الاهتزاز هذه كافية لكسر الطرف قليلا وتوسيع الفتحة. افحص فتحة الإبرة للتأكد من أن قطرها الخارجي يتراوح من 1.3 إلى 1.5 ميكرون والذي يمكن تأكيده بواسطة صور المجهر باستخدام عدسة موضوعية 40x. بعد ذلك ، اضبط ضغط الحقن من 50 إلى 75 hectopascals مع فاصل زمني مضغوط من 200 إلى 300 مللي ثانية واضبط ضغط التعويض المستمر عند 15 إلى 30 hectopascals لمنع التدفق العكسي المتوسط إلى الإبرة.

قم بتحميل مركب PKA / UCNP المحبوس بصبغة TAMRA في الموضع الخلفي للإبرة. ثم يتم إعداد الإبرة المحملة على مناور دقيق هيدروليكي واحد ، بزاوية من 30 درجة إلى 45 درجة. افحص الإبرة بالمجهر للتأكد من عدم وجود فقاعة تنشأ بعد تحميل العينة.

بعد غمر الإبرة في الوسط ، قم بالتبديل إلى وضع التألق ، لتأكيد إطلاق الصبغة عند تطبيق ضغط الحقن والإفراج البطيء عن الصبغة عند تطبيق ضغط التعويض باستمرار. ثم قم بالتبديل إلى وضع المجال الساطع المتباين للطور ، لبدء الحقن المجهري للخلية. يمكن ملاحظة موجة الصدمة الغشائية في الحقن الناجح.

اغسل الخلايا مرتين وتحقق من الخلايا المحقونة بحثا عن مضان TAMRA المحقون بشكل مشترك لتحديد موقع الخلايا المحقونة بنجاح. تشير الخلية التي تم قبول UCNP ولكن بدون إشارة صبغة محقونة مشتركة إلى تمزق غشاء الخلية أثناء الحقن ويجب استبعادها من المزيد من التجارب. قم بإشعاع الخلايا باستخدام صمام ثنائي ليزر 980 نانومتر في مسار ضوء الطبقة السفلية الذي تركز عليه عدسة موضوعية 10x لمدة 15 دقيقة.

اترك فاصلا زمنيا مظلما لمدة خمس دقائق بعد كل خمس دقائق من التشعيع لتجنب التسخين. إذا كانت هناك حاجة إلى وقت تنشيط أقصر ، مثل الثواني أو حتى الثواني الفرعية ، فما عليك سوى التبديل إلى عدسة موضوعية 40x للحصول على كثافة فوتون تركيز أعلى. بعد التحلل الضوئي واستعادة الخلايا ، قم بإصلاح الخلايا في مليلتر واحد أو 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة ، قبل أن يتبع المزيد من alexa 594 داخل التلوين.

أخيرا ، تصور تفكك ألياف الإجهاد الناجم عن NIR. بعد تشعيع الأشعة تحت الحمراء ، تظهر الخلايا المحقونة بالمجهرية باستخدام PKA / UCNP المحبوس كما هو موضح بواسطة الأسهم البيضاء انبعاث التحويل. تفكك ألياف الإجهاد الناجم عن التنشيط الضوئي الناجح ل PKA NIR ، يعرض المزيد من الأكتين وبالتالي يؤدي إلى تلطيخ أخضر قوي بالقرب من UCNP.

عنصر تحكم سلبي حيث يتم حقن الخلايا بشكل دقيق ولكنها تبقى في الظلام ، لا يظهر أي تفكك لألياف الإجهاد. يمكن تلطيخ مستوى التعرض للأكتين بعد التنشيط الضوئي للأشعة تحت الحمراء باستخدام Alexa 594 متبوعا بالصورة J. تم رسم منحنيات شدة تلطيخ الأكتين على طول السهم الأحمر ، مما يوفر معلومات كمية عن تفكك ألياف الإجهاد التي يمكن ربطها بنشاط PKA الناجم عن NIR. بمجرد التعرف على الحقن المجهري ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يوم واحد ، بما في ذلك التحضير ومراقبة الجودة ل PKA / UCNP في قفص.

من خلال تعليماتنا الخاصة بتعديلات أجهزتنا والتجارب ، يمكن تشغيل التفاعل المطلوب عن طريق الأشعة تحت الحمراء القريبة ، بدقة زمنية مكانية عالية مثل الأشعة فوق البنفسجية التقليدية لطرق المعايرة بالتحليل الحجمي ، ولكن بدون السمية الضوئية ، فهي ليست معدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، آمل أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل مركب الجسيمات النانوية الإنزيمي إلى الخلية عن طريق الحقن المجهري وتنشيط الإنزيم ضوئيا ، باستخدام الجرس المتوافق بالقرب من ضوء الأشعة تحت الحمراء. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الكيميائية ، الذين يحتاجون إلى استخدام الضوء لتحفيز التفاعل الأنزيمي المطلوب في الخلايا الحية من أجل الدقة الزمنية المكانية عندما لا تستطيع الخلية تحمل السمية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن ربط المؤثرات الحيوية الأخرى بالجسيمات النانوية التحويلية ، للإجابة على أسئلة إضافية تحتاج إلى تنشيط ضوئي زمني مكاني. إذا كان المؤثر الحيوي يعمل خارج الخلية ، فلن تكون هناك حاجة إلى الحقن المجهري. يمكن أن توفر منصة التنشيط الضوئي القريبة من الأشعة تحت الحمراء أيضا مزيدا من عمق الاختراق في الأنسجة ، وبالتالي يمكن تطبيقها في الصغيرة لتحفيز ردود الفعل المرغوبة في الوقت المحدد والموقع.