تحليل التفاعلات البروتين البروتين والمشاركة في توطين بين مكونات الفجوة، ضيق، والمالطيون تقاطعات في الغدد الثديية الفئران

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد ما إذا كان اثنان أو أكثر من بروتينات التوصيل بين الخلايا يتوجهان داخل الخلايا وإجراء تقييم إضافي لتفاعلهما الجسدي عبر الترسيب المناعي المشترك. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا مجال الغدة الثديية بما في ذلك الأدوار التي تلعبها التقاطعات في التطور الطبيعي وأمراض مثل سرطان الثدي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن توفر معلومات مهمة حول تفاعل البروتين والبروتين في الجسم الحي بتكلفة منخفضة نسبيا.

لإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي المشترك ، استرجع الشرائح المجهرية المناسبة من الفريزر. قم بإصلاح الأقسام على الفور عن طريق غمرها في أربعة بالمائة من الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغمر الشرائح في محلول ملحي مخزن بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة.

اترك الشرائح هناك حتى الانتقال إلى الخطوة التالية. ضع دائرة حول كل قسم من الشريحة باستخدام حاجز مسعور متاح تجاريا أو قلم مختبر مقاوم للماء. أضف قطرات من PBS على الفور إلى الأنسجة ، وضع الشريحة في غرفة الأنسجة البشرية لبقية الإجراء.

قم بسد كل قسم من الأنسجة ب 100 إلى 200 ميكرولتر من ثلاثة بالمائة من محلول ملحي من مصل الأبقار ، 0.1٪ بولي سوربات -20 ، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء انسداد العينات ، قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الأولية والثانوية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة في TBS 0.1٪ بولي سوربات -20. بعد إزالة محلول الانسداد عن طريق الشفط ، قم باحتضان الأقسام في 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق الشفط واغسل الأقسام ب 250 إلى 500 ميكرولتر من TBS 0.1٪ بولي سوربات -20 لمدة خمس دقائق. قم بإزالة محلول الغسيل عن طريق الشفط قبل تكرار الغسيل مرتين. قم بشفط محلول الغسيل واحتضان الأقسام ب 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق Fluoro-4 المناسب لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الشفط ، اغسل الأقسام ب 250 إلى 500 ميكرولتر من TBS 0.1٪ بولي سوربات -20 لمدة خمس دقائق. قم بإزالة محلول الغسيل وكرر مرتين. كرر هذه الخطوات باستخدام المزيج المناسب من الأجسام الأولية والثانوية لأي بروتينات لاحقة ذات أهمية.

بعد إزالة الغسيل النهائي ، قم بإجراء تلطيخ النوى عن طريق احتضان القسم ب 100 إلى 200 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل مليليتر DAPI و TBS 0.1٪ بولي سوربات -20 لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط محلول DAPI وتركيب الشرائح باستخدام وسيط تثبيت قابل للذوبان في الماء وغير فلوري وزلات غطاء. ضع الشرائح بشكل مسطح في ثلاجة بدرجة أربع درجات مئوية لمدة ثماني ساعات على الأقل.

انتقل إلى التصوير المجهري الفلوري كما هو موضح في بروتوكول النص. اجمع 500 إلى 1000 ميكروغرام من المحللة وقم بتخفيفها في PBS لكل منها حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر في كل أنبوب سعة 1.5 مل. أضف الجسم المضاد ضد المستضد المعني إلى الأنبوب الأول من المحللة ، واحتفظ به على الجليد.

احتضان الأنابيب طوال الليل عند أربع درجات مئوية على خلاط أنبوبي بكرة بسرعة منخفضة. في اليوم التالي ، أضف 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر للغسيل المسبق. ضع الأنابيب التي تحتوي على الخرزات على الحامل المغناطيسي واسمح للحبات بالهجرة نحو المغناطيس.

قم بإزالة المخزن المؤقت للتخزين من الخرزات باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. اغسل الخرزات بإضافة 500 ميكرولتر من PBS 0.1٪ بولي سوربات -20 ، وقم بدوامة الأنابيب بقوة لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واسمح للخرز بالهجرة نحو المغناطيس.

قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد عن طريق سحب العينات باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. أضف مركب تفاعل الجسم المضاد للحالزات إلى الخرزات واحتضانه لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الخلاط الأسطواني. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي واسمح للحبات بالهجرة نحو المغناطيس.

باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بشفط المحللة والتخلص منها وضع الأنابيب على الجليد. اغسل الخرزات مرتين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من PBS ، ووضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي ، وإزالة السائل كما كان من قبل. أثناء خطوات الغسيل ، تجنب الدوامة ، واحتفظ بالعينات على الثلج.

اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام PBS 0.1٪ polysorbate-20 دون دوامة وتخلص من آخر مخزن مؤقت للغسيل باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. للعزل ، أضف 20 ميكرولترا من الجلايسين الحمضي 0.2 مولار إلى الأنابيب ورجها لمدة سبع دقائق على الخلاط الأسطواني. بعد الطرد المركزي بسرعة عالية لبضع ثوان ، اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج بارد مثلج.

كرر خطوات الغسيل والشطف لكل أنبوب. ثم أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت 4x إلى العينة المملوءة بسعة 40 ميكرولترا. أضف على الفور ضرية واحدة إلى العينات المملوءة ، قطرة واحدة في كل مرة ، حتى يتحول لونها إلى اللون الأزرق ، ثم انتقل إلى الأنابيب التالية.

اغلي العينات المملحة على حرارة 70 إلى 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتحميل المحللات المحضرة والعينات المترسبة جنبا إلى جنب في هلام أكريلاميد SDS-PAGE. قم بتشغيل الجل في مخزن مؤقت للتشغيل عند 100 فولت لمدة 95 دقيقة تقريبا ، أو حتى تصل حافة البروتينات المهاجرة إلى قاع الجل.

بعد ذلك ، انقل المواد الهلامية إلى غشاء النيتروسليلوز أو PVDF باستخدام بروتوكول قياسي. بعد ذلك ، قم بسد الغشاء لمدة ساعة واحدة على الروك بسرعة منخفضة في TTBS الحليب الجاف بنسبة خمسة بالمائة. لتحديد ما إذا كان هطول الأمطار ناجحا ، قم بفحص الغشاء باستخدام الجسم المضاد الأول ضد البروتين المترسب.

قم بتخفيفه في خمسة بالمائة من الحليب الجاف TTBS بالتركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة. احتضان الغشاء طوال الليل عند أربع درجات مئوية على منصة هزاز مع تحريض بطيء. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع TTBS على منصة هزاز مع تحريض عالي.

بعد ذلك ، احتضان الغشاء في الجسم المضاد الثانوي المناسب المترافق مع بيروكسيداز الفجل ، المخفف في TTBS ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة مع تحريض بطيء. قم بإجراء ثلاث إلى ست غسلات ، كل منها لمدة خمس دقائق ، باستخدام TTBS على منصة هزاز مع تحريض عالي. قم بتحليل إشارة الجسم المضاد الثانوي عن طريق احتضان الغشاء بمحلول لومينول متاح تجاريا واتبع تعليمات الشركة المصنعة.

اكتشف الإشارة باستخدام نظام تصوير التلألؤ الكيميائي. لتحديد البروتينات المتفاعلة ، كرر هذه الخطوات باستخدام الأجسام المضادة المناسبة على نفس اللطخة. لتحديد ما إذا كان تقاطع الفجوة وتقاطع الالتصاق ومكونات التقاطع الضيق يمكن أن تتفاعل معا في الغدة الثديية ، تم إجراء فحوصات التألق المناعي المشترك.

يظهر اختبار التألق المناعي المشترك أن بيتا كاتينين ، وهو بروتين متكامل لتقاطع الملتصقات ، و Connexin 26 ، وهو بروتين تقاطع فجوة ، يتوجهان في غشاء الخلية في الفئران الغدد الثديية في يوم الرضاعة السابع ، كما ينعكس في اللون الأصفر. يتم تصور نوى الخلية بتلطيخ DAPI الأزرق. تم قطع عمليات الاستئصال بالتبريد من الغدد الثديية في يوم الحمل 18 وتلطيخها باللون المناعي الفلوري ل Claudin 7 ، وهو بروتين تقاطع محكم يظهر باللون الأخضر ، و E-Cadherin ، وهو بروتين تقاطع ملتصق موضح باللون الأحمر ، و Connexin 26 ، وهو بروتين تقاطع فجوة يظهر باللون الأزرق المرجاني.

كانت النوى ملطخة باللون الأزرق DAPI. يتم عرض تحديد موقع E-Cadherin و Claudin 7 باللون الأصفر إلى البرتقالي الفاتح ، بينما أدى تحديد موقع Connexin 26 مع E-Cadherin و Claudin 7 إلى تلطيخ أبيض متقطع. لمعرفة البروتينات الوصلية التي تختلط وتربط جسديا معا في غشاء الخلية ، تم إجراء الترسيب المناعي المشترك باستخدام أنسجة الغدة الثديية من الفئران المرضعة.

أظهرت النتائج أن Connexin 43 ، أحد مكونات تقاطع الفجوة ، يتفاعل مع E-Cadherin و Claudin 7 ، ولكن ليس مع Claudin 3. تم تأكيد هذه النتائج من خلال الترسيب المناعي المتبادل. عندما تم ترسيب E-Cadherin المناعي ، تفاعل مع Connexin 43 و Claudin 7.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين للتألق المناعي المشترك لأربع إلى ثماني شرائح ، ويمكن تصوير الشرائح في اليوم التالي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة إجراء التألق المناعي المشترك ، من المهم أن تتذكر اختيار أجسام مضادة مترافقة مختلفة من Fluoro 4 يتم رفعها في مساحات مختلفة بأطوال موجية غير متداخلة واختيار الخرز المغناطيسي المناسب للبروتين A أو G المتوافق مع الأجسام المضادة المستخدمة في الترسيب المناعي المشترك. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف تفاعل الوصلات بين الخلايا في الغدد الثديية الفئرانية.

لا تنس أن العمل خطير للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.