تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم المستمدة من الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم العلامات المختلفة التي تعبر عنها مجموعات ضبغية فرعية داخل الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة العصبية ، مثل البلاعم الاحترازية أثناء محاولتنا قيام الجهاز العصبي المركزي بالدوار ، وما هي الأنماط الظاهرية للجهاز العصبي المركزي في الضامة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في عزل عدد كبير من السكان الفرعيين للبلاعم عالية النقاء ، بالإضافة إلى تحديد علامة الخلايا الفرعية للبلاعم.

ابدأ باستخدام مقص ناعم لقطع الجلد البطني أسفل عملية الخنجري مباشرة لفضح التجويف الصدري. قم بعمل شق في الحجاب الحاجز ، وقم بقطع الجوانب الجانبية للقفص الصدري في اتجاه ذيلية إلى منقاري لكشف القلب. بعد تحديد البطين الأيسر والأذين الأيمن ، أدخل قسطرة فراشة بإبرة قياس 25 في البطين الأيسر.

قم بعمل شق في الأذين الأيمن وابدأ في إنتاج 20 مل من PBS من خلال القسطرة بمعدل عشرة ملليلتر في الدقيقة بمجرد أن يبدأ الدم في التدفق. سيتم الإشارة إلى وفرة ناجحة من خلال ابيضاض الرئتين والكبد أثناء إزاحة الدم. بعد ذلك ، استخدم مقصا دقيقا لتشريح العمود الفقري.

استئصال عضلات جدار البطن على الجانب البطني من العمود الفقري ، وقطع العمود الفقري عند قاعدة الذيل لإزالة العمود الفقري أثناء حصاده. أدخل حقنة سعة عشرة ملليلتر من PBS مزودة بطرف ماصة معدل سعة 200 ميكرولتر في الجانب القطني من العمود الفقري. ثم اغسل الحبل الشوكي على جانب عنق الرحم.

قم بإزالة الجلد فوق الجمجمة ، وأدخل طرفا واحدا من المقص في قاعدة الجمجمة. قطع الجمجمة بعد خياطة السهمية. ثم أدخل ملقطا صغيرا في القطع وقم بإزالة الجزء العلوي من الجمجمة برفق.

قم بتشريح الدماغ من رأس الفأر وإزالة البصلة الشمية والمخيخ. ثم ضع الدماغ والحبل الشوكي في أنبوب واحد خمسة ملليلتر يحتوي على نقطة واحدة واثنين وثمانية ملليلتر من كوكتيل الهضم. لفصل الخلايا ، استخدم مقصا صغيرا لتقطيع الدماغ والحبل الشوكي إلى قطعة إلى قطعة إلى ملليمترين مكعبتين وضع القطع عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، أوقف الهضم ب 20 ميكرولترا من EDTA خمسة مولار نقطة الصفر ، متبوعا بتجربة لطيفة باستخدام ماصة خمسة ملليلتر. قم بتصفية معلق الخلية الناتج من خلال مصفاة شبكية 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر باستخدام مكبس حقنة سعة عشرة ملليلتر لنقع أي أنسجة متبقية في الدماغ أو الحبل الشوكي برفق. اشطف المصفاة ب 20 مل من خمسة بالمائة FBS و PBS.

وجمع الخلايا المفلترة عن طريق الطرد المركزي. ثم ، قم بشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. لفصل التدرج الكثافة للخلايا ، نقوم بتعليق الحبيبات بأربعة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة بنسبة 30 بالمائة ، وننقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.

ضع تحت الأساس برفق أربعة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة 37 بالمائة ، متبوعا بأربعة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة بنسبة 70 بالمائة تحت وسط تدرج الكثافة بنسبة 37 بالمائة. انقل الأنبوب إلى جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لفصل الخلايا. ستكون الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم في واجهة طبقات التدرج الكثافة 70 و 37 بالمائة.

سيظهر الأنبوب طبقيا. بعد إزالة الطبقة العليا من المايلين بعناية ، انقل ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من طبقة الطور البيني للبلاعم الصغيرة إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا. ثم اغسل الخلايا المناعية بثلاثة أجهزة طرد مركزي في 15 مل من PBS ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS بعد الغسيل النهائي.

لتقييم تعبير علامة البلاعم الفرعية ، انقل الخلايا إلى أنبوب تحليل قياس التدفق الخلوي بسعة خمسة ملليلتر ، متبوعا بإضافة ميكرولتر واحد من كاشف بقعة الخلايا الميتة القابل للإصلاح. بعد 30 دقيقة على الجليد ، محمي من الضوء ، اغسل العينات في ملليلترين من PBS ، وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس لكل أنبوب تحليل تجريبي. قسم الخلايا إلى العدد المناسب من أنابيب تحليل قياس التدفق الخلوي بسعة خمسة مليلتر.

ثم قم بحظر ارتباط مستقبلات FC غير المحددة بميكروغرام واحد من كوكتيل الأجسام المضادة CD 16 CD 32 لكل 100 ميكرولتر من الخلايا لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد ، محمي من الضوء. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المناسبة ، لمدة 30 دقيقة على الجليد ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في ملليلترين من PBS أربع مرات.

ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 30 دقيقة على الجليد ، محمية من الضوء ، تليها أربع غسلات في PBS كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الكريات برفق في 100 ميكرولتر من واحد بالمائة بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. ثم اغسل الخلايا أربع مرات في PBS.

أعد تعليق الكريات النهائية في 200 ميكرولتر من PBS الطازج ، وقم بتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الدماغ والحبل الشوكي والضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة بناء على تعبير CD 11 B و CD 45. يسمح التعبير عن CX3CR1 و Tmem119 بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة المتوسطة CD 11 B الإيجابية CD 45 بتمييز هذه الخلايا بشكل أكبر عن CD 11 C إيجابيات CD 45 الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية العالية ، والتي لا تعبر عن أي من هذه العلامات ، ولكنها تعبر عن CCR2.

بعد فصل تدرج الكثافة ، لا يزال 85 إلى 95 بالمائة من الخلايا قابلة للحياة. في حالة عدم وجود عزل تدرج الكثافة ، لا يمكن التعرف على مجموعات البلاعم الفرعية في مخطط مبعثر أمامي ثنائي الجانب ، بسبب وجود خلايا غير ضامة ، وحطام المايلين. نظرا لأن الحاتمة المعترف بها من قبل الجسم المضاد ل Tmem119 داخل الخلايا ، فإن النفاذية مطلوبة لوضع العلامات على علامة الخلايا الدبقية الصغيرة المهمة هذه.

لاحظ أن النفاذية تحفز انكماش الخلية ، مما يتسبب في ظهور مجموعات ضماء فرعية أصغر من خلال تحليل التشتت الأمامي مقابل الجانبي. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد تدرج الكثافة بعناية فائقة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل rt-PCR الكمي للإجابة على أسئلة إضافية حول مسارات إشارات البلاعم الفرعية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف تنشيط البلاعم الفرعية في نموذج الفئران للأمراض العصبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب عليك إما إجراء اختبار أو اتباع هذا التقليد كمجموعات سكانية فرعية للبلاعم عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام غطاء المحرك أثناء تنفيذ هذا الإجراء.