كوانتينغينغ المتفرعة الكثافة في الجرذ الغدة الثديية كله يتصاعد باستخدام طريقة تحليل شول

الهدف العام من هذه الطريقة المعتمدة على الحاسوب هو القياس الكمي الموضوعي لكثافة تفرع الغدة الثديية وتضاؤل التفرع، وهما مؤشران نمويان مهمان في القوارض، وذلك من خلال تطبيق تحليل شول (sholl analysis) مُعدّل على صور التثبيت الكامل للغدة الثديية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات في مجال بيولوجيا الغدة الثديية، مثل كيفية تأثير التعرض للمواد الكيميائية على نمو الغدة الثديية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدامها لبرمجيات مفتوحة المصدر للقياس الكمي الموضوعي للخصائص الأساسية لنمو الغدة الثديية.

بالنسبة لهذا الإجراء، يجب توفير صور للعينات الكاملة (whole-mounts) تظهر الظهارة الغدية بتكبير ثابت. للبدء، افتح صورة في برنامج ImageJ. بعد ذلك، اختر أداة الرسم الحر (freehand tool).

قم بتحديد محيط الظهارة الغدية وتنظيف المنطقة المحيطة بها. بعد ذلك، قم بتحديد محيط العقدة الليمفاوية وإزالة هذا الجزء من الصورة باستخدام أمر القص. إذا كانت خلفية الصورة سوداء، فيجب تحويلها إلى اللون الأبيض.

انقر فوق تحرير (Edit)، ثم خيارات (Options)، ثم ألوان (Colors). في مربع الحوار، اختر اللون الأبيض من القائمة المنسدلة لخيارات الخلفية. وعلى الرغم من أن الخلفية قد تظل باللون الأسود، إلا أنه سيتم التعامل معها كخلفية بيضاء عند معالجة الصورة.

الآن، قم بفصل قنوات الألوان إلى ثلاث صور تدرج رمادي ثمانية البتات. بعد ذلك، اختر القناة التي توفر أفضل تباين، والتي عادةً ما تكون القناة الزرقاء. الآن، قم بطرح الخلفية من قناة اللون المختارة.

بعد ذلك، انتقل إلى اختيار المعلمات المطلوبة ومعاينة التغييرات. قم بتفعيل خيار الخلفية الفاتحة والمعاينة في مربع الحوار، ثم اضبط عدد البكسلات حتى يتم الحصول على التباين المطلوب. وفي حال الحاجة إلى تباين إضافي، استخدم خيار Unsharp Mask.

قم بمراجعة المعاينة (Preview) في مربع الحوار، واضبط نصف قطر البكسل (pixel radius) ووزن القناع (mask weight) حتى يتم الحصول على التباين المطلوب. بعد تطبيق مرشح القناع غير الحاد (unsharp mask filter)، قم بإزالة الإطار الذي أنشأه المرشح. انقر على زر السهم الأحمر المزدوج في شريط الأدوات واختر أدوات الرسم (Drawing Tools).

بعد ذلك، اختر أداة الممحاة (Eraser tool). قم بتعديل قطرها من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على زر أداة الممحاة، ثم اضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر لمسح الحدود. يُسمح بعملية تراجع (Undo) واحدة فقط أثناء المسح، لذا يجب توخي الحذر.

بعد تطبيق أحد المرشحات، قم بإزالة الضوضاء المتبقية يدويًا. ارجع إلى نسخة من الصورة الأصلية وقم بإزالة الضوضاء المحددة عن طريق النقر أولاً على زر السهم الأحمر المزدوج في شريط الأدوات واختيار أدوات الرسم. ثم، اختر أداة الممحاة.

قم بتعديل قطر أداة الممحاة من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على زر أداة الممحاة. بعد ذلك، اضغط مع الاستمرار على زر الماوس الأيسر لمسح الضجيج. يُسمح بعملية تراجع واحدة فقط أثناء المسح، لذا يرجى توخي الحذر.

بعد ذلك، قم بضبط عتبة الصورة. حرك أشرطة التمرير لضبط قيم العتبة الدنيا والقصوى لتحسين صورة الغدة. ثم انقر فوق تطبيق.

قم بإزالة الضوضاء الإضافية تلقائياً باستخدام أي من طريقتين. الخيار الأول هو استخدام أمر despeckle. والخيار الثاني هو استخدام أمر remove outliers.

تقوم هذه العملية باستبدال البكسل فقط بقيمة الوسيط للمحيط المباشر له إذا انحرف البكسل عن الوسيط بمقدار يتجاوز قيمة عتبة يحددها المستخدم. الآن، وباستخدام الصورة الأصلية للمقارنة، قم بإعادة بناء أجزاء من الظهارة الغدية التي تمت إزالتها بواسطة عملية تحديد العتبة وإزالة الضجيج. عند إعادة بناء الصورة، تأكد من القيام بذلك بعناية وبأدنى حد ممكن للحفاظ على سلامة الصورة.

اختر أداة بخاخ الرش من أدوات الرسم. انقر بزر الماوس الأيمن على زر أداة بخاخ الرش لضبط حجم الأداة، ثم املأ الأقسام المفقودة من الغدة بعناية باستخدام زر الماوس الأيسر. بعد ذلك، أنشئ صورة هيكلية للغدة من أجل تحليل شول (sholl analysis).

أولاً، قم بتحويل الصورة إلى تنسيق ثنائي. بعد ذلك، قم بإجراء عملية الهيكلة (skeletonization) للصورة؛ حيث يتم حذف البكسلات من حواف الصورة الثنائية بشكل متكرر حتى يتم اختزالها إلى شكل بعرض بكسل واحد.

الآن، قم بتوسيع الصورة مرة واحدة لسد الفجوات الناتجة عن عمليتي العتبة والتقليص الهيكلي. بعد ذلك، احفظ الصورة كملف جديد باستخدام أمر "حفظ باسم". وأخيراً، تحقق من دقة الصورة الهيكلية مقارنة بالأصل عن طريق تراكب الصورتين.

في مربع حوار إضافة صورة، اختر صورة الهيكل العظمي واضبط درجة شفافيتها عند 30%، ثم احفظ التراكب كصورة جديدة للرجوع إليها مستقبلاً. للبدء، افتح صورة هيكل عظمي وحول الصورة إلى صيغة ثنائية، ثم حدد مقياس الصورة.

أدخل عدد البكسلات لكل مليمتر، ثم اضبط كلًا من المسافة المعروفة ونسبة عرض البكسل على القيمة واحد، ثم اختر المليمتر كـوحدة للطول وقم بتفعيل الخيار العام لتطبيق المقياس على جميع الصور. بعد ذلك، حدد نصف القطر النهائي لتحليل شول (sholl analysis) باستخدام أداة رسم الخطوط؛ حيث يتم رسم خط من بداية القناة الرئيسية وصولاً إلى أبعد نقطة في الظهارة الغدية.

بعد ذلك، اضغط على مفتاح M وسيتم الإبلاغ عن طول الخط. الآن، قم بإدخال إعدادات تحليل شول (sholl analysis). أولاً، اختر الخيارات في قسم تعريف القشور (definition of shells)، وقم بتعيين نصف القطر الابتدائي على 0.00 millimeters وقم بتعيين حجم خطوة نصف القطر على 0.1 millimeters.

اضبط عدد العينات على واحدة. سيتم إدخال طول الخط الذي تم رسمه للتو تلقائياً في حقل نصف القطر النهائي. وبالنسبة لخيارات العينات المتعددة لكل نصف قطر، اختر المتوسط (mean) لعملية التكامل.

بالنسبة للواصفات وخيارات الملاءمة المنحنية، اضبط قيمة قطع نصف القطر المحيط على واحد. اختر "استنتاج من نصف القطر الابتدائي" لعدد الفروع الأساسية، وحدد خياري الملاءمة الخطية وأفضل درجة ملاءمة. ثم، تحت قسم المخططات البيانية بدون تسوية، اختر "الأكثر إخبارية".

الآن، ضمن قسم طرق شول (sholl methods)، اختر المنطقة للملف التعريفي المعياري (area for normalized profile). وأخيرًا، في قسم المخرجات (output)، حدد خيار إنشاء قناع التقاطعات (create intersections mask) لعمل خريطة حرارية للتقاطعات. الآن، افتح نافذة معاينة للصورة التي تحتوي على الحلقات وتحقق من منطقة التحليل.

إذا كانت جميع الإعدادات صحيحة، انقر فوق موافق (okay) لتشغيل التحليل. سيؤدي تشغيل التحليل إلى إنشاء نافذة خطية لملف شول (sholl profile linear window)، ونافذة شبه لوغاريتمية لملف شول (sholl profile semi-log window)، ونافذة لنتائج شول (sholl results window) تحتوي على جميع قيم مخرجات شول، ونافذة لأسماء ملفات ملفات شول (sholl profiles window) توضح عدد التقاطعات عند كل نصف قطر كما حددتها الدالة متعددة الحدود. لقياس MEA، ابدأ العمل من الصورة الهيكلية للغدة في برنامج ImageJ.

افتح أداة المضلع وارسم مضلعاً حول محيط الغدة. استخدم نقرات الماوس لإضافة قطع مستقيمة. وعندما يتم تحديد كامل المنطقة الظهارية، انقر نقراً مزدوجاً لإغلاق المضلع.

بعد ذلك، اضغط على مفتاح M لفتح نافذة النتائج. تتوافق القيمة الموجودة في عمود المساحة مع MEA. إذا كان الظهارة الغدية ممتدة إلى ما وراء العقدة اللمفاوية، فاطرح مساحة العقدة اللمفاوية من MEA عند حساب كثافة التفرع.

يمكن قياس منطقة العقد اللمفاوية بنفس طريقة قياس MEA. وباستخدام الطرق الموصوفة، تم تحليل مجموعتين من الجرذان المتطابقة في العمر. عولجت الحيوانات في المجموعة B بمادة كيميائية معروفة بأنها تسبب تطوراً مبكراً للغدد الثديية.

يوضح رسم عدد تقاطعات الفروع على طول نصف القطر من الغدة التباين في النتائج. وقد كشفت نتائج تحليل شول (Sholl analysis) عن فرق واضح في متوسط عدد التقاطعات بين المجموعات. ومع ذلك، يجب تطبيع بيانات التقاطعات بالنسبة لمساحة الغدة الثديية لاستخلاص الاستنتاجات.

يوفر تحليل شول (sholl analysis) وقياسات مساحة الظهارة في الغدة الثدية معلمين فسيولوجيين مفيدين لإجراء تحليل مقارن. ومن الواضح أن حجم الغدد كان أكبر بكثير في مجموعة العلاج. ويعطي تحليل شول قيمة مجموع N (Sum N)، والتي تُستخدم لحساب كثافة التفرع وقيمة k.

في مجموعة العلاج، يشير ارتفاع متوسط كثافة التفرع وانخفاض متوسط القيمة k، والتي تعكس انخفاض معدل تلاشي التفرع، إلى أن الحيوانات المعالجة تمتلك غددًا أكثر تطورًا من الحيوانات غير المعالجة. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن عملية إزالة الضجيج هي الخطوة الأكثر أهمية؛ حيث إن إزالة قدر كبير جدًا أو قليل جدًا من الضجيج يمكن أن يؤدي إلى زعزعة سلامة الغدة وتشويه النتائج.

عند استخدام هذه الطريقة، من المهم البدء بعينة ثدية كاملة وسليمة. حيث لا يمكن الحصول على صورة هيكلية دقيقة في حال وجود عيوب، مثل التمزقات أو الطيات. ويتطلب إنشاء صورة هيكلية دقيقة الصبر والممارسة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 15 إلى 20 دقيقة لكل غدة يتم تحليلها إذا تم ذلك بشكل صحيح.