الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بلورات عالية الجودة من ظروف فحص التبلور الأولية. يمكن استخدام البلورات لدراسة هياكل البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي ومجمعاتها. أصبح شيء ما عن الهياكل الجزيئية أمرا صعبا بشكل متزايد.

كما أن توفير مجموعة متنوعة من الشروط الأولية يزيد من إنتاجية البلورات المفيدة ، مع تقليل الحاجة إلى تحسين العينة والبلورات. يسهل النظامان المؤتمتان بالكامل ، LMB ، إعداد ما يصل إلى 1،920 تجربة نشر بخار في قطرات نانولتر. للإيجاز ، من المفترض أن المستخدمين على دراية بالفعل بالوظائف الأساسية وصيانة موزع النانولتر والطابعة النافثة للحبر وسدادة الألواح اللاصقة.

قبل تنفيذ الإجراء ، تأكد من تهيئة روبوتات النظام وفتح برنامج التحكم الخاص بها. قم بتشغيل مبرد حامل تبريد الأنبوب ، قبل حوالي 30 دقيقة من بدء البرنامج الرئيسي. ضع لوحة اختبار على حامل SBS الآلي لجهاز السدادة اللوحة.

قم بتشغيل مانع تسرب اللوحة وتأكد من تطبيق الفيلم بشكل صحيح. كرر هذا الاختبار مرتين أخريين للتحقق من أن مانع تسرب اللوحة جاهز. ثم أضف 20 لترا من الماء منزوع الأيونات إلى الحاوية الرئيسية لمعالج السائل.

افصل إدخالات التوصيل من الحاوية الأصغر لمحلول شطف الإيثانول بنسبة 20٪ ، وقم بتوصيل الإدخالات بالحاوية الرئيسية. أدخل اسم الشاشة المناسب على شاشة اللمس الخاصة بالطابعة النافثة للحبر. ثم افتح وأغلق الباب الدائري لتشغيل الدوران الدائري.

افتح الباب عندما تقدم المكدس الأول. قم بتحميل المكدس الأول بالكامل ب 22 لوحة تبلور ، كل منها بعمود واحد متجها للخارج. قم بتحميل المكدسين التاليين بالكامل بنفس الطريقة.

قم بتحميل اللوحات الستة المتبقية في أعلى المواضع في المكدس الرابع ، ثم أغلق باب الرف الدائري. تحقق من أن شاشة المبرد تشير إلى 14 درجة مئوية. اقلب مجموعات الفحص المحددة برفق وبشكل متكرر لمدة دقيقة واحدة.

ثم افتح اللوحة الأمامية لمعالج السوائل. افتح الأنابيب وضعها في حامل التبريد في التصميم القياسي المكون من 96 بئرا. عند وضع كل أنبوب في الحامل ، ضع غطاءه على الدرج في نفس التصميم المكون من 96 بئرا.

عند استخدام النظام 1 ، يتم وضع خيوط الملصقات على الدرج في تخطيط 96 بئرا لتمكين التحقق من ترتيب الأنابيب بشكل صحيح. تحقق من مواضع الأنبوب ثم تأكد من أن جميع الأنابيب مستوية ومستقرة في الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.

في نافذة بدء التشغيل الخاصة ببرنامج معالج السوائل، حدد تشغيل الصيانة وافتح برنامج Flushing. قم بتشغيل البرنامج لطرد الإيثانول بنسبة 20٪ من النظام وغسل الأجزاء الخارجية من أطراف توزيع السائل. عند اكتمال التنظيف، انقر فوق إلغاء للعودة إلى بدء التشغيل.

حدد تشغيل عملية موجودة وانقر فوق بدء التحديد. افتح برنامج توزيع مجموعة MRC. املأ 18 بوصة للمثيلات في شاشة التكوين وقم بتشغيل البرنامج ، وراقب النظام حيث يتم تسمية اللوحات الأربعة الأولى وتعبئتها وإغلاقها.

لا تترك النظام دون رقابة حتى يكتمل إعداد اللوحات الأربع الأولى. بمجرد تحضير جميع الألواح البالغ عددها 72 لوحة ووضعها مرة أخرى في الرف الدائري ، قم بتبديل إدخالات التوصيل من حاوية الماء منزوعة الأيونات إلى حاوية الإيثانول بنسبة 20٪. قم بتشغيل برنامج تدفق بدء التشغيل باستخدام نفس العملية كما كان من قبل.

قم بإيقاف تشغيل المبرد وتخلص من أنابيب مجموعة الغربلة الفارغة. قم بإزالة الألواح ال 72 المحضرة بعناية من الرف الدائري. تخلص من الألواح المملوءة بشكل غير صحيح أو سيئة الإغلاق.

قم بتخزين الأطباق الجاهزة للاستخدام على حرارة 10 درجات مئوية. تأكد أولا من تشغيل روبوتات النظام ، ويتم تهيئة موزع النانو لتر مع فتح برنامجه ، وفتح مدير طريقة معالج السوائل. قم بتشغيل حامل تبريد الأنبوب الدقيق قبل حوالي 15 دقيقة من بدء البرنامج الرئيسي.

ضع لوحة اختبار على حامل SBS الآلي لجهاز السدادة اللوحة. قم بتشغيل مانع تسرب اللوحة وتحقق من أن اللوحة محكمة الغلق بشكل صحيح. اختبر مانع التسرب ثلاث مرات.

ثم قم بتشغيل موزع النانولتر لضبط 100 قطرة نانولتر من محلول الاختبار في لوحة اختبار. يظهر هنا صورة مجهرية ضوئية لقطرة سعة 100 نانولتر ، تنتجها موزع النانو لتر ، مع محلول الاختبار المصنوع من صبغة حمراء. أغلق برنامج موزع النانولتر وقم بإزالة كتلة حامل الشريط من سطح السفينة.

بعد ذلك ، يتم وضعه في حامل لوحة مصمم خصيصا ، وهو لوح تبلور 96 جيدا مملوءة مسبقا مع أعلى كمية نسبية من الكواشف المتطايرة في ظروفها. قم بإزالة الفيلم اللاصق من اللوحة. افتح اللوحة الأمامية لمعالج السائل ، وضع اللوحة غير المختومة على السطح في الجزء الخلفي من الحامل المنزلق الأول.

قم بتغطية اللوحة بغطاء من الألومنيوم SBS. قم بتثبيت الغطاء باتجاه الزاوية اليسرى الخلفية من الحامل عن طريق الضغط برفق على الزاوية المقابلة للغطاء. عند استخدام النظام 2 ، يجب معالجة مجموعات الفحص التي تحتوي على كميات كبيرة من الكواشف المتطايرة أولا.

هذا يتجنب التكثيف الذي يتشكل على خيوط SBS ، مما قد يؤثر على التسليم الآلي للخيوط أو ختم اللوحة. قم بفك الإغلاق ، وقم بتحميله في الناقلات المنزلقة ، وقم بتغطية الألواح ال 19 المتبقية بنفس الطريقة ، والعمل من معظم الظروف إلى الأقل تقلبا. بمجرد أن يكون حامل تبريد الأنبوب الدقيق عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح بالضوء الأخضر ، قم بإزالة غطاءه.

اقطع غطاء أنبوب دقيق يحتوي على 440 ميكرولترا على الأقل من عينة البروتين. تأكد من عدم وجود رغوة في العينة فوق الغضروف المفصلي ، لأن ذلك سيتداخل مع نظام الكشف عن السائل. ضع الأنبوب في الموضع 1 من حامل تبريد الأنبوب الدقيق.

ضع لوحة PCR على سطح معالج السائل أمام حامل محول تحريك اللوحة. ثم أغلق اللوحة الأمامية. في واجهة إدارة أسلوب معالج السائل، حدد لوحات الإعداد.

راقب تهيئة كلا النظامين واملأ معلمات التشغيل، بما في ذلك نوع اللوحة وعدد القطرات لكل شرط، وحجم القطرة، وموضع اللوحة الأولى المراد معالجتها، وعدد اللوحات. انقر فوق لا عندما تسأل عما إذا كنت ترغب في المساعدة في تحميل المجموعة. بمجرد التحقق من عدم وجود رفوف تلميح فارغة، انقر فوق موافق. بمجرد التحقق من وجود تلميحات كافية للتشغيل ، انقر فوق موافق. عند الضرورة، قم بتحديث نظام إدارة الإكرامية وانقر فوق موافق. تأكد من أن سطح موزع النانولتر خال من كتلة حامل الشريط ، وأن الحامل في الجزء الخلفي من مداخن الأطراف سعة 50 ميكرولتر ، خال من أغطية SBS المصنوعة من الألومنيوم.

تحقق جيدا من أن جميع المكونات الأخرى المطلوبة جاهزة ثم ابدأ العملية. راقب النظام حيث يقوم موزع النانولتر بضبط القطرات في اللوحة الأولى ، ثم يقوم مانع تسرب اللوحة لاحقا. لا تترك النظام دون رقابة حتى يكتمل إعداد اللوحة الأولى.

بمجرد تحضير جميع الألواح ال 20 بقطرات التبلور والعودة تلقائيا إلى الناقلات المنزلقة ، افتح اللوحة الأمامية وقم بإزالة الألواح برفق. تأكد من أن الألواح محكمة الغلق بشكل صحيح قبل تخزينها للتبلور. قم بتنظيف أغطية SBS بمحلول الإيثانول بنسبة 20٪ قبل تكديسها على الجانب الأيسر من معالج السوائل للتخزين.

تخلص من لوحة PCR والأنبوب الصغير. قم بإيقاف تشغيل حامل تبريد الأنبوب الدقيق وامسح التكثيف. اترك منشفة ورقية فوق السطح المبرد لامتصاص المزيد من التكثيف.

ثم استبدل غطاء الحامل وأغلق اللوحة الأمامية. تم فحص OmpF و MreB في البداية باستخدام هذه البروتوكولات المؤتمتة بالكامل. تم العثور على بلورات OmpF ذات الجودة الكافية لحيود الأشعة السينية في البئر A4 من لوحة LMB 7.

تم العثور على بلورات جودة الحيود من MreB في البئر D12 من لوحة LMB 20. يعد تخزين ألواح الوقود المسبقة عند 10 درجات مئوية حلا وسطا لتجنب التجميد والتخزين عند 4 درجات ، مما قد يتسبب في تدهور ظروف التبلور والمشكلات المتعلقة بالتكثيف. عند تخزينها بهذه الطريقة ، يمكن استخدام الألواح في غضون أربعة إلى خمسة أشهر.

يتم إنتاج ما بين 4 و 8 ، 000 لوح LMB سنويا مع النظام 1 وتستخدم لاحقا للفحص الأولي. يجب تحسين البروتوكولات بشكل مختلف عندما يكون معدل دوران المبيعات المتوقع أقل بكثير. عادة ما تستخدم مجموعتنا الكاملة من ألواح ما قبل الوقود كشاشة أولية كبيرة لعينة جديدة.

ومع ذلك ، يمكن اختيار عدد أقل من اللوحات لمتطلبات عينة محددة. بعد تحضير القطرات ، يتم تخزين الألواح على أرفف منخفضة الاهتزاز مع التحكم بإحكام في درجة الحرارة عند 4 أو 18 درجة مئوية. يتم تقييم التجارب باستخدام مجاهر مصدر الضوء اللولبي.

بعد التحقيق الدقيق في طبيعة البلورات ، يمكن تحليل السمات وأوجه التشابه عبر الظروف باستخدام الأدوات المستندة إلى الويب مثل قواعد بيانات LMB أو C6 Screen. قد يظل التحسين اللاحق لظروف التبلور ضروريا. يتم وصف البروتوكولات الآلية الإضافية ، مع طرق 4 زوايا والفحص الإضافي في مخطوطتنا.