Name: الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: تعلم بروتوكولات التبلور الآلية لإعداد بلورات عالية الجودة من البروتينات والحمض النووي باستخدام أنظمة التبخير النانولترية. هذه الطريقة تُسرّع دراسات البيولوجيا الهيكلية وتُحسّن إنتاجية التجارب بشكل كبير.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

مرفق تبلور لجنة نهر الميكونج-LMB يرجى دعم من مجلس البحوث الطبية (المملكة المتحدة). ونشكر أعضاء LMB لدعمهم: أولغا بيريسيتش (PNAC) وتوني وارن، والأنف والحنجرة فإن دن فوسينيتا وبات إدواردز (دراسات الهيكلية)، ستيف سكوتشير والأعضاء الآخرين في "ورشة ميكانيكية"، نيل المنح وجو وستمورلاند (بصرية)، بول هارت وتوم برات (IT). نود أيضا أن نشكر ستيف إليوت (تيكان، المملكة المتحدة) وستيوارت ميتشل وهيذر رينغروس (الروبوتات هاملتون، المملكة المتحدة)، وبول ذوبان الجليد، وروبرت لويس وجوبي جنكينز (TTP لابتيتش، المملكة المتحدة)، بول ريردون (AG سويسسي، سويسرا)، دونالد Ogg (الفابيوتيتش، وجورج ستيفنس المملكة المتحدة)، نيل وليامز (ماركيم إيماجي، المملكة المتحدة) وغراهام هاريس (الوكالة كليفلاند) للحصول على مساعدة تقنية.

1-اثنين مؤتمتة بالكامل نظم (الفحص الأولى)
<ol><li>
النظام 1: إعداد 72 تبلور 96-جيدا لوحات مليئة بفرز مجموعات (لوحات LMB)
	<ol>
<li>قبل تنفيذ هذا الإجراء، ضمان أن يتم تهيئة الروبوتات الخاصة بالنظام والبرامج الخاصة بهم المسيطر مفتوح. تشغيل المبردات لتبريد الأنبوب الناقل حوالي 30 دقيقة قبل أن يتم تشغيل البرنامج الرئيسي.</li>
		<li>ضع لوحة اختبار الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. تشغيل السدادة لوحة والتحقق من أن الفيلم يتم تطبيقها بشكل صحيح. كرر هذا الاختبار مرتين أكثر للتحقق من أن السدادة لوحة جاهزة.</li>
		<li>ثم إضافة 20 لتر مياه إلى الحاوية الرئيسية معالج السائل. قطع إدراجات اقتران الحاوية الصغيرة (20% إيثانول الشطف الحل) وتتصل إدراج الحاوية الرئيسية.</li>
		<li>أدخل اسم الشاشة المناسبة (الجدول 1) على لمس الطابعة النافثة للحبر. ثم فتح وإغلاق باب دائري لتحريك دوران دائري. فتح الباب عند المكدس الأولى يطرح نفسه.</li>
		<li>تحميل الكامل المكدس الأولى مع 22 تبلور لوحات، بعضها مع العمود 1 التي تواجه بها. تحميل الكامل مكدسات اثنين التالية بنفس الطريقة.</li>
		<li>تحميل لوحات 6 المتبقية في مناصب أعلى المكدس الرابعة. ثم، قم بإغلاق باب دائري.</li>
		<li>تحقق من أن عرض المبردات يشير إلى 14 درجة مئوية. بلطف وبشكل متكرر عكس مجموعات الفرز المحدد لمدة 1 دقيقة. ثم افتح اللوحة الأمامية لمعالج السائل.</li>
		<li>فتح الأنابيب ووضعها في الناقل التبريد وفقا لتخطيط 96-جيدا القياسية (A1، A2، إلخ.). عند وضع كل أنبوبة في الناقل، وضع لها غطاء على صينية في نفس التخطيط 96-جيدا.</li>
		<li>تدقيق الأنبوب المواقف والتأكد من أن جميع الأنابيب الصعيد واستقروا في الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.</li>
		<li>في إطار 'بدء التشغيل' من البرنامج معالج السائل، حدد 'تشغيل صيانة' وفتح برنامج التنظيف. قم بتشغيل برنامج لمسح الإيثانول 20% من النظام ويغسل السطح الخارجي لنصائح الاستغناء عن سائل.</li>
		<li>عند اكتمال المسح، انقر فوق 'إلغاء الأمر' للعودة إلى 'بدء التشغيل'. حدد 'تشغيل عملية القائمة' وانقر فوق 'ابدأ التحديد الخاص بك'. افتح برنامج 'لجنة نهر الميكونج الاستغناء عن مجموعة'. في '18' ملء الشاشة 'الحالات' في التكوين وتشغيل البرنامج.</li>
		<li>مراقب النظام كما وصفت اللوحات الأربع الأولى، شغل، ومختومة.</li>
		<li>مرة واحدة وقد أعدت جميع لوحات 72 ووضع مرة أخرى في دائري، التبديل إدراج اقتران من الحاوية الرئيسية إلى حاوية صغيرة. قم بتشغيل برنامج 'بدء تدفق' (راجع الخطوة 1.1.10).</li>
		<li>إيقاف تشغيل في المبردات وتجاهل إفراغ فرز أنابيب كيت. بعناية إزالة لوحات استعداد 72 من دائري. تجاهل لوحات مملوءة بشكل غير صحيح أو مختومة. تخزين لوحات جاهزة للاستخدام عند 10 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
نظام 2: إعداد قطرات تبلور (100 nL البروتين + 100 nL شرط) من عينة واحدة في لوحات LMB 20
	<ol>
<li>أولاً، ضمان الروبوتات للنظام في، يتم تهيئة موزع نانولتر البرمجيات المفتوحة، وأسلوب إدارة معالج السائل في مفتوح. تشغيل الناقل microtube والتبريد حوالي 15 دقيقة قبل أن يتم تشغيل البرنامج الرئيسي.</li>
		<li>ضع لوحة اختبار الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. تشغيل السدادة اللوحة، وتأكد من أن اللوحة مختومة بشكل صحيح. اختبار السدادة لوحة ثلاث مرات.</li>
		<li>ثم قم بتشغيل موزع نانولتر لتعيين 100-nL قطرات من اختبار حل في لوحة اختبار. الاختيار تحت مجهر أن القطرات تم تعيينها بشكل صحيح. قم بإغلاق البرنامج موزع نانولتر وإزالة الحظر قطاع-حامل من على سطح السفينة.</li>
		<li>المقبل، أدخل في حامل لوحة مصممة خصيصا (انظر نتائج الممثل: "تبلور الأجهزة المتقدمة" في LMB) لوحة LMB مع الكمية النسبية أعلى من الكواشف متقلبة في شروطه (الجدول 1). إزالة الفيلم لاصقة من اللوحة.</li>
		<li>افتح معالج السائل اللوحة الأمامية ووضع لوحة تفض على سطح السفينة، في الجزء الخلفي من أول ناقل انزلاق (انزلاق الناقلين قد سحب لسهولة الوصول إليها).</li>
		<li>وتغطي اللوحة مع غطاء ألومنيوم SBS. تسوية الغطاء نحو الركن الأيسر الخلفي من الناقل بتطبيق ضغط لطيف على الركن المقابل من الغطاء.</li>
		<li>فتح وتحميل الناقلين انزلاق، وتغطي لوحات 19 المتبقية بنفس الطريقة، يعمل من أكثر الأوضاع المتقلبة على الأقل. مجرد الناقل microtube والتبريد عند 4 درجة مئوية، كما يتبين من ضوء الأخضر، إزالة غلافه.</li>
		<li>قطع غطاء microtube التي تحتوي على ميليلتر (على الأقل) 440 من البروتين العينة (الجدول 2). ضمان أن العينة قد لا رغوة أعلاه غضروف، وهذا سوف تتداخل مع نظام كشف السائل. ضع الأنبوبة في 1 موقف الناقل microtube والتبريد.</li>
		<li>ضع لوحة بكر على سطح سائل معالج أمام نقل لوحة محول الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.</li>
		<li>بعد تحميل سطح السفينة، ضمان أن السفينة موزع نانولتر واضح كتلة قطاع-حامل وأن الناقلين في الجزء الخلفي من الكدسات نصيحة 50 ميليلتر واضحة من الأغطية SBS الألومنيوم.</li>
		<li>في سائل معالج واجهة '"أسلوب إدارة"'، وحدد 'إعداد لوحات'. رصد التهيئة لكلا النظامين، وملء في معلمات التشغيل. اتبع المبادئ التوجيهية "إدارة أسلوب" الواجهة (المطالبات والأرقام ونظام إدارة تلميح تعليمات بإعداد).</li>
		<li>التحقق من أن كافة المطلوبة مكونات مستعدون، ثم قم بتشغيل العملية.</li>
		<li>مراقبة النظام كما يعين الصيدلي نانولتر القطرات في اللوحة الأولى والأختام السدادة لوحة بعد اللوحة.</li>
		<li>متى أعدت مع قطرات تبلور جميع لوحات 20 وعاد تلقائياً إلى الناقلين انزلاق، فتح اللوحة الأمامية وإزالة اللوحات بلطف. تحقق من أن اللوحات مختومة بشكل صحيح قبل تخزينها للتبلور.</li>
		<li>تنظيف الأغطية SBS مع حل إيثانول 20% قبل التراص لهم على الجانب الأيسر من معالج السائل للتخزين. تجاهل لوحة بكر و microtube.</li>
		<li>إيقاف الناقل microtube والتبريد ومسح بعيداً من التكثيف. اترك منشفة ورقية فوق السطح برودة لاستيعاب مزيد من التكثيف. استبدال الغطاء الناقل ثم أغلق اللوحة الأمامية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-الاستغلال الأمثل للظروف
<ol><li>
معالج السائل على أساس حقنه: إنتاج التدرجات الخطية اثنين من تركيزات في الخزانات من صفيحة تبلور (الأسلوب 4-ركن).
	<ol>
<li>أولاً، ضمان على معالج السائل وتهيئة البرمجيات المفتوحة.</li>
		<li>في 'التدرج' التبويب: فتح البرنامج المطلوب، حدد نوع لوحة تبلور ووحدة التخزين النهائي في الخزانات المائية (الجدول 3). ينبغي خفض الإعداد المتقدمة من أجل 'ماكس المجلد النار' من 6000 إلى 3000 عند استخدام الحلول التي تحتوي على [كحولالايسوبروبيل] > 10% v/v و [MPD] > 20% v/ف.
</li>
		<li>التحضير الحقن. ضع مكبس في كل حقنه (ينتهي أشار إلى أسفل) وإدراج الجزء الخلفي المحاقن الأخاديد المعين تحت رأس الروبوت. تطور حقنه عقارب الساعة تأمينه في موقف (سيتم تشغيل البرنامج فقط مع جميع المحاقن المطلوبة مرفقة بشكل صحيح).</li>
		<li>إعداد في أحواض. إزالة الإطار الفولاذ المقاوم للصدأ، وإدراج في أحواض. وتتوافق مع مواقف 4 على اليسار زوايا 4 أ، ب، ج، "د التبديل" إلى التبويب '"إعداد"' الذي يعرض وحدات التخزين للحلول المطلوبة في كل حقنه (في الجدول 3، 0.5 مل حجم القتلى تمت إضافة إلى وحدات التخزين عرض). صب الحلول الزاوية في أحواض بها كل منهما ووضع الإطار مرة أخرى على سطح السفينة (الإطار يحمل في الموقف مع 2 مغناطيس صغيرة تقع في الجزء الأمامي السفينة). طريقة بديلة للمضي قدما في هذه الخطوة صب الحلول أحواض عند سبق وضعها على سطح السفينة-
</li>
		<li>ضع لوحة تبلور على الناقل SBS يجهز.</li>
		<li>انقر فوق 'نضح' والانتظار لهذه الخطوة أن يكتمل (عند توقف بيستونز في طريقهم حتى).</li>
		<li>قم بالتبديل إلى علامة التبويب 'تشغيل'، وتشغيل البرنامج.</li>
		<li>عند انتهاء البرنامج، العودة إلى علامة التبويب إعداد ثم انقر فوق 'إزالة': النظام التطهير الحقن من بقايا الحلول، وثم كل وسيلة يرفع بيستونز. يمكن طلب 'تطهير' بدلاً من 'إزالة'؛ وهذا سوف يغادر بيستونز في الموضع السفلي، استعداد لنضح حلول أكثر مع المحاقن نفسه.
</li>
		<li>إزالة المحاقن بالتواء لهم الفيلتر.</li>
		<li>تجاهل المحاقن وأحواض في بن المناسبة (أو شطف لهم مع المياه ومن ثم 20% v/v الإيثانول الحل لإعادة الاستخدام).</li>
		<li>ختم اللوحة ووضعه على خلاط ميكروسكوبية دقيقة 3 1,000 لفة في الدقيقة أو 10 دقيقة عند اختلاط الحلول عالية اللزوجة. اللوحة على استعداد لتشكيل قطرات تبلور على موزع نانولتر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مضافة فحص بروتوكول 1 (إعداد قطرات تبلور في صفيحة تبلور 96-جيدا قبل مليئة بالشاشة المضافة)
	<ol>
<li>أولاً، إعداد الشرط مع التركيزات المبدئية من الكواشف التي زادت بنسبة 10% (المجلد الحد الأدنى 15 مل عند نقل الشرط من حاوية على الشاشة المضافة مع معالج السائلة).</li>
		<li>التأكد من أن المعالج السائل على استعداد للعمل. افتح برنامج 'شاشة إضافة إلى المواد المضافة' لوحة واحدة (إدخال وحدة التخزين في المستودعات المائية: '72 ميليلتر'). يطالبك، الأرقام ومساعدة (12 × 1,000 ميليلتر نصائح اللازمة) نظام إدارة تلميح مع التأكد من الروبوت على استعداد للعمل وفقا للتحديدات.
</li>
		<li>استرداد الشاشة المضافة من الحاضنة-20 درجة مئوية وإزالة الختم الألومنيوم به فورا (استخدام حامل لوحة)، ثم ضع اللوحة على سطح السائل المعالج. البرنامج يعمل وفقا لتخطيط عمودي (يتم وضع اللوحة مع A1-الزاوية الموجود في الجزء الأيمن الأمامي من الناقل). كما وضع أيضا حاوية مليئة بالشرط. قم بتشغيل البرنامج.</li>
		<li>مرة واحدة قد ملئت خزانات اللوحة، وضعه على شاكر الميكروسكوبية وتشغيل البرنامج. شطف الحاوية للشرط مع الإيثانول منزوع الماء ونسبة 20% لإعادة استخدامها.</li>
		<li>
إعداد القطرات على موزع نانولتر. أولاً، فتح لوحة تبلور (استخدام حامل اللوحة). ثم، مكان اللوحة والبروتين 8-جيدا قطاع في المرتبة الأولى من كتلة قطاع-حامل. تعرض علامة التبويب 'الإعداد' على البرمجيات مراقبة المواقف الفعلية لكل مكون على سطح السفينة. تحميل كل جيدا للقطاع بعينه البروتين وفقا لحجم قطره المطلوبة (الجدول 4). قم بتشغيل برنامج إعداد قطرات.
</li>
		<li>عند انتهاء البرنامج، إزالة اللوحة من على سطح السفينة وختم ذلك فورا (استخدام لوحة السدادة، شريط لاصق عريضة 3 بوصة). تجاهل في القطاع في حاوية المناسبة.</li>
		<li>تقدير الحجم والشكل، وتوسيط من قطرات تحت المجهر قبل التخزين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مضافة فحص بروتوكول 2 (إعداد قطرات تبلور في صفيحة تبلور 96-جيدا مع شاشة مضافة القابلة لإعادة الاستخدام)
	<ol>
<li>أولاً، إعداد الشاشة المضافة: ترك لوحة الثقافة المجمدة 96-جيدا الخلية المقابلة لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم الطرد المركزي الشاشة المضافة في 1,000 غ س ل 2 دقيقة.</li>
		<li>إعداد الشرط (المجلد الحد الأدنى 15 مل عند نقل الشرط من حاوية على الشاشة المضافة مع معالج السائلة).</li>
		<li>ملء الخزانات من صفيحة تبلور 96-جيدا مع الشرط. في معالج السائل، المضي قدما بنفس الطريقة كبروتوكول 1، الخطوة 2.2.2، ولكن إدخال '80 ميليلتر' لوحدة التخزين في المستودعات.</li>
		<li>إعداد القطرات على موزع نانولتر مع 3 عناصر على سطح السفينة (لوحة تحتوي على الشاشة المضافة، جنبا إلى جنب مع لوحة تبلور وقطاع البروتين 8-جيدا في المركز الأول من كتلة قطاع-حامل، الجدول 4).</li>
		<li>إغلاق لوحة الثقافة الخلية التي تحتوي على الشاشة مع ورقة ألومنيوم ووضعه مرة أخرى في الحاضنة-20 درجة مئوية.</li>
		<li>تقدير الحجم والشكل، وتوسيط من قطرات تحت المجهر قبل التخزين.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15325645">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBBZV.pdf">X-Ray Diffraction of Protein Crystals.</a> Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).</li>
<li>Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Structures-A+Series+of+Fortunate+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events.</a> Biophys. J. 95, 1-9 (2008).</li>
<li>Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376864/">Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences.</a> 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/500706">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889891004430">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001317">High-throughput protein crystallization.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).</li>
<li>Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE+high-throughput+crystallization%2C+crystal+imaging+and+recognition+techniques%3A+current+state%2C+performance+analysis%2C+new+technologies+and+future+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).</li>
<li>Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23860256">Membrane protein structure determination-the next generation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).</li>
<li>Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652247">Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+approach+to+initial+crystallization+screening+of+proteins+is+under-sampled%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled.</a> J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).</li>
<li>Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+implementation+of+precise+grid+screens%3A+the+four-corners+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1016/S1535-5535-04-00123-6">Technological Advancements in Liquid Handling Robotics.</a> JALA. 6, 36-40 (2001).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1016/j.jala.2004.04.020">Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology.</a> JALA. 9, 257-261 (2004).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Robot+for+High-throughput+Crystallization+of+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).</li>
<li>Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Success+Rate+of+Protein+Crystallization+by+Random+Microseed+Matrix+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening.</a> J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).</li>
<li>Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+UV+detection+of+protein+crystals+enabled+by+fluorescence+excitation+at+wavelengths+longer+than+300+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).</li>
<li>Szewczak, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Structural+studies+of+the+bacterial+MreBCD+complex%22">Structural studies of the bacterial MreBCD complex</a>. , University of Cambridge, UK. (2016).</li>
<li>Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+dengue+virus+type+1+envelope+protein+in+the+postfusion+conformation+and+its+implications+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion.</a> J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).</li>
<li>Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi+sampling%3A+a+methodical+and+flexible+approach+to+initial+macromolecular+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+%CE%B1-helical+membrane+protein+crystallization%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update.</a> Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MORPHEUS+II+protein+crystallization+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The MORPHEUS II protein crystallization screen.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitting+the+target%3A+fragment+screening+with+acoustic+in+situ+co-crystallization+of+proteins+plus+fragment+libraries+on+pin-mounted+data-collection+micromeshes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).</li>
<li>Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+Implementation+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Protein+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography.</a> JALA. 21, 97-106 (2015).</li>
<li>Zipper, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+to+reduce+evaporation+of+crystallization+droplets+by+using+plate+lids+with+apertures+for+adding+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcrystal+manipulation+with+laser+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microcrystal manipulation with laser tweezers.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).</li>
<li>Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+Evaluations+of+the+Reproducibility+of+Vapor-Diffusion+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).</li>
<li>Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923710">The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).</li>
<li>McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022024886901715">The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins.</a> J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).</li>
<li>Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022024898008525">Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids.</a> J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).</li>
<li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+silver+bullets%3A+an+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+screens+developed+at+the+MRC+Laboratory+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoPlex%3A+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparse-matrix+screening+of+chemical+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.</a> Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).</li>
<li>Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+rationalization+of+crystallization+screening+for+small-+to+medium-sized+academic+laboratories%3A+the+PACT%2FJCSG%2B+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08893110410001664837">Automated Evaluation of Crystallisation Experiments.</a> Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).</li>
<li>Snell, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+training+set+through+the+visual+analysis+of+crystallization+trials.+Part+I%3A+%E2%88%BC150+000+images%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
<li>Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cg1004209">The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions.</a> Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).</li>
</ol>

نعلن بموجب هذا مصلحة تجارية متضاربة منذ ليفيارك تتاجر العناصر التالية: 96-و 48-البئر MRC اللوحات، ختم قطره معلقة MRC، شاشات تبلور MORPHEUS, Pi، انغستروم و LMB.

1-إعداد واستخدام شاشات الأولى المخزنة في لوحات
ينبغي أن تكون مختلطة فرز مجموعات قبل يجري الاستغناء عن إلى لوحات لفصل هطول الأمطار أو المرحلة الخفيفة يحدث في بعض الأنابيب أثناء التخزين. عند شاشة يتكون من اثنين من مجموعات (أنابيب 2 × 48)، يوضع في الأنبوب الأول من المجموعة الثانية في موقع E1 الناقل التبريد. عند شاشة تتألف من 4 مجموعات (أنابيب 4 × 24)، ويوضع في الأنبوب الأول من المجموعة الثانية في موقع C1 وتوضع الأنبوبة الأولى من المجموعة الثالثة في موقع E1 وتوضع الأنبوبة الأولى من المجموعة الرابعة في موقع G1. أثناء إدخال الأنابيب في الناقل التبريد، وأغطية توضع على صينية بعد تخطيط قياسي 96-جيدا المشهد. حيث ترد أعدادا جيدا على رأس الأغطية حسب الشركات المصنعة، وهذا يتيح التدقيق إذا وضعت جميع الأنابيب في الترتيب الصحيح. وهذا يساعد أيضا على استبدال الأغطية الصحيحة في الأنابيب عند ملء عدد مخفض من لوحات.
نقوم بتخزين لوحات معبأ مسبقاً في 10 درجة مئوية، إلى حل وسط لتجنب تجميد وتخزين عند 4 درجة مئوية التي قد تتسبب في تدهور الأوضاع والقضايا مع الختم. يتم تخزين لوحات لتصل إلى عدة أشهر مع عادة لا التكثيف ملحوظ على الوجه الداخلي للختم. وهذا صحيح أقل للوحات LMB05، LMB06، LMB09، و LMB10 كما تتضمن هذه الشروط مع تركيزات عالية نسبيا من الكواشف المتقلبة (الجدول 1). كمية صغيرة من التكثيف على الجانب الداخلي من الختم يقلل من كفاءة الختم، ويمكن أن يسبب التلوث المتبادل بين الآبار أثناء إعلان اللوحات. للمساعدة في منع التكثيف أثناء التبريد الأولية، يمكن نقل لوحات أولاً من دائري إلى نزهة معزول برودة التي يتم تخزينها في غرفة باردة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تبريد بطيئة جداً يقلل من وضع تدرجات حرارة داخل الآبار مختومة ومن ثم يقلل التكثيف الإجمالية15. وباﻹضافة إلى ذلك، حالما يتم تخزين اللوحات في الحاضنة 10 درجة مئوية، يوضع غطاء البوليستيرين SBS مخصصة داخلية على اللوحة في الجزء العلوي من كل مكدس (غير معروضة).
يمكن استخدام مجموعة كاملة من ألواح معبأ مسبقاً كشاشة أولية كبيرة ضد عينة بروتين رواية، للذوبان في الماء،. وبدلاً من ذلك، يمكن تحديد لوحات أقل بحيث تتطابق مع المتطلبات المحددة. على سبيل المثال، LMB15 و LMB19 هي الشاشات التي وضعت خصيصا لغشاء بروتين العينات26،27، أو LMB20 شاشة وضعت مع الذرات الثقيلة لتسهيل تجريبي على مراحل حيود البيانات28 (انظر أيضا : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">وضع الشاشات تبلور البروتينات MORPHEUS</a>).
2-إعداد قطرات تبلور
عند استخدام نظام 2، فحص مجموعات مع كميات كبيرة من الكواشف متقلبة ينبغي معالجتها أولاً. تجنب هذا التكثيف تشكيل على مطاط الأغطية SBS، التي يمكن أن تؤثر على التعامل مع غطاء وختم اللوحة. غطاء SBS قد قليلاً من إزالة الألغام عند أعلى لوحة، الذي السبب في أنها تحتاج إلى أن يكون الانحياز في البداية (انظر البروتوكول، خطوة 1.2.6). وحدات التخزين الميت البروتين في الآبار التي بليت PCR هي سخية نسبيا (ميليلتر 0.8، أسطورة انظر الجدول 2). لاحظ أن يعمل وحدات التخزين الميت سخية على قدم المساواة عند استخدام موزع نانولتر فردياً مع البروتين في شرائط 8-جيدا (الجدول 4). قد تعمل وحدات التخزين الميت أصغر، لكن بعض العينات التقيد بالنصائح، معايرة الروبوت قد يصبح غير دقيق بعض الشيء، قد تكون الغرفة أكثر دفئا من المعتاد، إلخ. كل ما يؤدي إلى خسائر العينة المشمولة بوحدات التخزين الميت السخية من أجل ترسيخ النهج.
التطورات الأخيرة مكنت زيادة تصغير تجارب و وبالتالي يمكن تخفيض حجم العينة المطلوبة لفحص ظروف تبلور إلى حد كبير بإدماج المقابلة التكنولوجيا29،30 . ومع ذلك، بعض الجوانب لمزيد من التصغير تحتاج إلى دراسة متأنية، مثل تبخر قطرات31 والتلاعب في ميكروكريستالس32.
وأخيراً، يمكن إدماج الطرد المركزي اللوحة (2,000 لفة في الدقيقة، 1 دقيقة) كخطوة أخيرة روتينية عند إعداد قطرات تبلور (في الآبار العلوي كروية). قد يقلل حجم وشكل قطرات الناتجة عن الطرد المركزي أكثر اتساقا إمكانية تكرار نتائج القضايا33،34. ومن المؤكد أن سيخفف قطرات متوسط تقييم لاحق لتجارب باستخدام مجهر البؤري المطلوب سوف تكون مماثلة عبر لوحة كاملة.
3-مزايا الأسلوب 4-الزاوية
أهم ميزة الأسلوب 4-ركن هو بساطته، الأمر الذي يقلل من الأخطاء ويسهل البروتوكولات الآلي مباشرة. على سبيل المثال، سيتم وضع الحلول الركن 4 دائماً على سطح سائل معالج بعد نفس التخطيط. أيضا، كافة البرامج على أساس نسب ثابتة بين الحلول (الشكل 3). إعداد دليل للحلول الركن 4 المفضل لمعالجة الآلي للحلول في التركيزات العالية التي يمكن أن تكون عالية اللزوجة. ثم سريعة ودقيقة نسبيا تطلع/الاستغناء عن الممكن في معظم أنواع معالجات سائلة مع الحد الأدنى من المتطلبات لتحسين الطبقات السائلة. ومع ذلك، قد تكون بعض الحلول ركن لزج جداً لروبوت العاملة مع نظام سائل تعمل بكفاءة. وهذا السبب اخترنا معالج سائلة العاملة مع الإزاحة الموجبة (الشكل 3B).
بالإضافة إلى التدرجات الخطية 2 تركيزات، يمكن اختبار مكون ثالث (أي، مجموعة من المخازن المؤقتة/المواد المضافة) بتركيز مستمر بطريقة مريحة. ولهذا الغرض، أعد كمية كبيرة نسبيا من مجموعة أساسية من زاوية الحلول بتركيز أعلى تأهيلاً مناسباً، باستثناء المكون لتكون متنوعة، أولاً. ثم، يتم إضافة الأسهم الحلول بما في ذلك هذا المكون لضبط تركيزات النهائي. على سبيل المثال، يتم إعداد 50 مل مجموعة من 4 ركن الحلول في تركيزات أعلى 10% من البداية. ثم يتم تقسيم هذه المجموعة الأساسية إلى 5 مجموعات فرعية أصغر من 4. أخيرا، يتم إضافة 10% في حجم الحموضة العازلة مختلف الحلول لكل مجموعة فرعية.
4-أشكال وأنواع من الشاشات المضافة
يتم عادة تخزين في-20 درجة مئوية (الشكل 4) نظراً لأنها لا تستخدم بانتظام على شاشات وتحتوي على المركبات المتطايرة/غير المستقرة. يجب أن يخطط له استخدام شاشة المضافة المجمدة مخزنة في كتلة عميق جيدا (1 مل في الآبار) مبكرا لأنه سوف يستغرق 12-24 ساعة لجميع الحلول المضافة ذوبان الجليد تماما في درجة حرارة الغرفة. أيضا، العديد من المستخدمين مشاركة نفس الشاشة المضافة، يحتمل أن يسبب مشاكل التلوث عبر. وأخيراً، ارتفاع كتل عميقة جيدا يجعلها غير مناسبة لمعظم نانولتر موزعات. كحل مناسب للالتفاف حول هذه القضايا، ينبغي نقل الشاشة من كتلة عميق جيدا إلى لوحات منخفضة المستوى (الشكل 4).
تاريخيا، كانت شاشات المضافة التي تشمل مجموعة متنوعة واسعة من الكواشف واحدة (مع تركيزات واحد) شعبية جداً35،36. ومع ذلك، تم وضع أنواع أخرى من شاشات المضافة التي تدمج يمزج المضافات37 أو تخفيض عدد المواد المضافة واحدة وجدت في تركيزات مختلفة38. وأخيراً، نهج تكميلي للتحقيق في تأثير المواد المضافة على العينات قبل تبلور39،40.
5-أكثر من الاعتبارات
الممارسة الجيدة: معظم الشاشات تحتوي على المواد الضارة أو السامة حتى و ومن ثم يجب أن تستخدم الحماية الشخصية المناسبة خلال البروتوكولات. على قدم المساواة، نقل أجزاء من الروبوتات قد يؤدي إلى وقوع إصابات، لا سيما عند محاولة التدخل يدوياً أثناء تشغيل برنامج (على الرغم من أن معظم الروبوتات بزر الإيقاف الطوارئ/نظام). بسبب التعقيدات التقنية المعنية، العادية التحقق من الروبوتات والشاشات والبرامج مع سابقا تتميز عينات اختبار هام لمستويات عالية مستديمة في إمكانية تكرار نتائج.
الإنتاجية: كمؤشر، بين 4,000 إلى 8,000 LMB لوحات يتم إنتاجها سنوياً مع نظام 1 (وتستخدمهم في وقت لاحق المستخدمين للفحص الأولى). هو لم تتكيف الأسهم كمية كبيرة من لوحات شغلها قبل الساعة 10 درجات مئوية عند الدوران المتوقع أقل بكثير، كبعد 4-5 أشهر، بعض الظروف سوف تبدأ في التدهور وتتبخر. تم تنفيذ نهوج مختلفة لبروتوكولات الأتمتة للمختبرات الصغيرة إلى المتوسطة الحجم41.
تخزين وتقييم تجارب: وبعد إعداد القطرات، يتم تخزين لوحات على الرفوف المنخفضة-الاهتزاز في غرفة في 4 أو 18 درجة مئوية مع درجة الحرارة التي تسيطر عليها أحكام (+/-0.5 درجة مئوية الحد الأقصى للانحراف). يتم تقييم تجارب باستخدام المجاهر مصدر الضوء الباردة. مختلف نظم التصوير الآلي متوفرة تجارياً، ولكن ينبغي النظر بعناية جميع جوانب: ستكون كافية لإنتاجية عالية السرعة المطلوبة لمسح لوحة؟ سوف تتداخل الكائنات عدا بلورات مع ضبط تلقائي للصورة؟ هل ستكون كافية لبقعة بلورات صغيرة جداً (لا سيما حول حافة القطرات) نوعية الصور الناتجة عن ذلك؟ 42 , 43 , 44
مقارنة بين تبلور الشروط: بعد تحقيقات دقيقة حول الطبيعة البلورات التي تم الحصول عليها في البداية، واحد تحليل الاتجاهات وأوجه التشابه عبر شروط استخدام <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB شاشة قاعدة البيانات</a> أو C6 <a href="http://c6.csiro.au/">أداة ويب</a>45.

يتم تطبيق علم البلورات بالأشعة السينية على نطاق واسع لزيادة تعزيز فهمنا للآليات البيولوجية والأمراض على المستوى الذري ومساعدة بعد ذلك النهج العقلاني ل اكتشاف المخدرات1. ولهذا الغرض، تنقية وعينات الجزيئات مركزة (2-50 مغ/مل) من البروتين والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وغيرها يغاندس وهذه المجمعات تجربته لميلها إلى نموذج أمر المشابك ثلاثية الأبعاد من خلال بلورة2،3 ،4. عندما يتم الحصول على بلورات ذات جودة عالية التي ديفراكت الأشعة السينية، يمكن حلها بنية بلورية في القرب من القرار الذري5،6. من الأهمية بمكان لا يمكن التنبؤ بالظروف المؤاتية لبلورة نموذج رواية وعائد بلورات ذات جودة عالية عادة ما تكون منخفضة جداً. هو أحد الأسباب الكامنة وراء أن العديد من عينات من الفائدة الخصائص البيوكيميائية صعبة، مما يجعلها غير مستقرة في مقياس الوقت المطابق لبلورة (عادة بضعة أيام). وأخيراً، تتفاقم العملية الوقت المطلوب لإنتاج عينات ونماذج المتغيرات، والأمثل على تنقية وبلورة7،8.
شرط بلورة حل مع مرسب الذي يقلل من قابلية الذوبان في العينة، وتحتوي على شروط غالباً أيضا المخازن المؤقتة والمواد المضافة. مئات من هذه الكواشف هي ملائمة تماما لتغيير معلمات التجارب تبلور لديهم ميل منخفضة لتتداخل مع سلامة العينة (مثل البروتين أو تتكشف الحمض النووي). في حين اختبار الملايين من مجموعات من الكواشف تبلور ليس ممكناً، اختبار عدة للعديد من مجموعات الفحص-صيغت مع مختلف الاستراتيجيات9،10 -ممكن مع المحاكمات المنمنمة والبروتوكولات الآلي. من هذا المنظور، الأسلوب الأكثر قابلية على الأرجح نشر بخار مع 100-200 nL قطرات يجلس على بئر صغيرة فوق خزان يحتوي على بلورة الشرط (25-250 ميليلتر)، نفذت في بلورة المتخصصة لوحات11 , 12-العينة البروتين والشرط غالباً ما يقترن بنسبة 1:1 لإجمالي حجم 200 nL عند إعداد القطرات في العلوي-الآبار. تبلور البروتينات نانولتر الروبوتية يمكن تنفيذها بتقنيات بديلة ولوحات مثل دفعة النفط وكيل13 و المرحلة مكعب Lipidic14 (آخر واحد يجري تطبيقها على بروتينات الغشاء ترانس التي على وجه التحديد ضعيف جداً للذوبان في الماء).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">مرفق تبلور في لجنة نهر الميكونج-LMB</a> وقد بدأ في وقت مبكر 2000s، وقدم موجز مبكر لدينا بروتوكولات الآلي في 200515. وقدم مقدمة تاريخية لبلورة البروتينات وأيضا نهج مخطط تفصيلي لمزايا نانولتر الروبوتية (ثم نهجاً جديداً للتجريب الروتينية). منذ تبلور الجزيئات هو أساسا عملية عشوائية مع المعلومات السابقة مفيدة جداً قليلاً أو لا، توظيف مجموعة متنوعة واسعة من الظروف الأولية (مناسبة) زيادة العائد من نوعية حيود بلورات16. وإلى جانب ذلك، ميزة كثيرا ما يغفل من شاشة أولية كبيرة التقليل من الحاجة إلى التحسين من عينات والبلورات في كثير من الحالات. وبطبيعة الحال، واحدة قد لا تزال بحاجة إلى المضي قدما في الاستغلال الأمثل لبعض الشروط الأولية في وقت لاحق. عادة، ثم يجري التحقيق تركز الكواشف ودرجة الحموضة بشكل منهجي. يمكن أيضا إدخال الكواشف أكثر إلى الشروط الأمثل لتغيير المعلمات لبلورة المزيد. ومن المؤكد أن واحدة ينبغي محاولة بلورة مع عينة طازج، ومن ثم البروتوكولات المقابلة يجب أن تكون واضحة ومتاحة أي وقت.
وهنا اثنين مؤتمتة بالكامل النظم المصممة في لجنة نهر الميكونج-LMB (نظم 1 و 2) والبروتوكولات المناظرة ويرد وصف كامل. التطبيق الرئيسي لهذين النظامين الأولى الفحص قبل نشر بخار في الجلوس لوحات تبلور قطره. يدمج النظام 1 معالج سائل ودائري الآلي لوحات الأسهم، طابعة النافثة لحبر للوحة العلامات والسدادة لوحة لاصقة. على نظام 1, 72 96-جيدا لوحات مليئة بمستلزمات الفرز المتوفرة تجارياً (80 ميليلتر من شرط نقل إلى الخزان من حجم ابتداء من 10 مل في أنابيب الاختبار)، والمسمى ومختومة. ثم يتم تخزين اللوحات في حاضنة 10 درجة مئوية حيث أنها تكون متوفرة للمستخدمين في أي وقت (كشاشات الأولى دعا 'لوحات LMB').
يتكامل نظام 2 معالج سائل وموزع نانولتر السدادة لوحة لاصقة. على النظام تنتج 2، يجلس قطرات (100-1,000 nL) لبخار نشر التجارب عن طريق الجمع بين الظروف والعينة في العلوي-آبار 20 48-96 جيدا أو لوحات المملوء مسبقاً مع الظروف. وهذا يعني 1,920 الفحص الأولى شروط تجربته عند استخدام لوحات LMB 20 على نظام 2.
الروبوتات تستخدم أيضا على حدة للاستفادة المثلى الشروط المحددة، ويرد أيضا وصف للبروتوكولات شبه الآلي المقابلة. ويستخدم الأسلوب 4-ركن17 بشكل روتيني لإنتاج شاشات الأمثل. ويتطلب البروتوكول الملحق أولاً إعداد دليل لحلول 4 ('أ، ب، ج، ود'). ثم يتم تلقائياً إنشاء التدرجات الخطية اثنين من تركيزات (لاثنين من عملاء تبلور الرئيسي) مباشرة إلى الخزانات من صفيحة التبلور. ولهذا الغرض، يوزع معالج سائل على أساس حقنه الحلول الركن 4 في نسب مختلفة.
لمواصلة تحسين شرط، واحد يمكن أن تستخدم شاشات المضافة التي يحتمل أن تعزز خصائص البلورات الناتجة عن18. النهجين متاحة للفحص المضافة: بروتوكول بدءاً من المواد المضافة إلى الاستغناء عن إلى خزانات لوحات تبلور قبل إعداد القطرات (بروتوكول 1) وبروتوكول آخر حيث يتم الاستغناء عن الشاشة المضافة مباشرة على القطرات (2 من البروتوكول).
وترد أيضا التطورات المفيدة الأخرى التي كانت قد بدأت في لجنة نهر الميكونج-LMB لتيسير بلورة الجزيئات الآلي،. أساسا، تبلور اللوحات والأجهزة المرتبطة بها مثل غطاء تكويم المجتمع من الجزيئية البيولوجية الفحص (SBS) أن يقلل تبخر شروط عند استخدام نظام 2.
للإيجاز، فمن المفترض أن المستخدمين على دراية بالوظائف الأساسية وصيانة موزع نانولتر والطابعة النافثة للحبر والسدادة لوحة لاصقة. ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم وضع لوحات على ظهر السفينة الروبوتات أن A1 جيدا ('A1-الزاوية') نحو الركن الأيمن الخلفي حاملة لوحة.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO & reg;</td><td>معالج السوائل Tecan</td><td>n / a</td><td>(النظام 1). الشفط / الاستغناء على أساس سائل النظام. يدمج دائري آلي. EVOware بالإضافة إلى برنامج التحكم v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&reg; ستار & تجارة;</td><td>Hamilton</td><td>n / A</td><td>معالج السوائل (النظام 2). الطموح / الاستغناء على أساس الإزاحة الإيجابية (تقنية CO-RE&TRADE). برنامج التحكم Hamilton STAR v.4.3.5.4785 مع واجهة إدارة الأساليب.</td></tr><tr><td>البعوض & ريج;</td><td>TTP Labtech</td><td>n / موزع</td><td>نانولتر قائم على Microsynringe يستخدم لإعداد القطرات (النظام 2 والمستقل) ، سطح 3 مواضع. برنامج التحكم v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>اليعسوب & ريج;</td><td>TTP Labtech</td><td>n / معالج</td><td>سائل قائم على الحقنة يستخدم لإنتاج شاشات التحسين (طريقة 4 زوايا). برنامج التحكم v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>آلة سدادة الألواح اللاصقة</td><td>Brandel</td><td>n / a</td><td>مدمجة في النظامين 1 و 2 (تستخدم أيضا كروبوت قائم بذاته).</td></tr><tr><td>طابعة نافثة للحبر 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n / a</td><td>مدمجة في النظام 1. واجهة شاشة تعمل باللمس.</td></tr><tr><td>شاشات < قوية > تبلور < / شاشة كريستال قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>التجارة ؛ 1</td><td>مجموعة تبلور هامبتون للأبحاث</td><td>HR2-110</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في شاشة كريستال LMB01</td></tr><tr><td>2 & التجارة ؛</td>مجموعة تبلور <td>هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-112</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB01</td></tr><tr><td>Wizard & trade ؛ طقم تبلور Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في LMB02</td></tr><tr><td>Wizard & trade ؛ طقم تبلور Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في شاشة وتجارة الشبكة LMB02</td></tr><tr><td>؛ كبريتات الأمونيوم</td><td>هامبتون للأبحاث</td><td>HR2-211</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen & Trade ؛ مجموعة تبلور PEG / LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen & Trade ؛</td>مجموعة <td>تبلور هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-221</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في شاشة الشبكة LMB03</td></tr><tr><td>؛ كلوريد الصوديوم</td><td>هامبتون للأبحاث</td><td>HR2-219</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen & Trade ؛ طقم تبلور PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في شاشة وتجارة الشبكة LMB04</td></tr><tr><td>؛ </td> مجموعة تبلور MPD <td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في LMB04</td></tr><tr><td>MemFac & trade ؛</td>مجموعة تبلور <td>هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-114</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في LMB04</td></tr><tr><td>PEG / Ion & trade ؛</td>مجموعة تبلور <td>هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-126</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB05</td></tr><tr><td>Natrix & trade ؛</td><td>مجموعة تبلور هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-116</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite & trade ؛</td>مجموعة <td>تبلور هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-128</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n / a</td><td>مجموعة تبلور (أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB06</td></tr><tr><td>Wizard & Trade ؛ مجموعة تبلور Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في LMB07</td></tr><tr><td>Wizard & trade ؛ مجموعة تبلور Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في مجموعة التبلور LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في مجموعة التبلور LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في مجموعة التبلور LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB09</td></tr><tr>مجموعة تبلور <td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في مجموعة التبلور LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في مجموعة التبلور LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 1 درجة الحموضة 4.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل شرط) المستخدمة في LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 1 درجة الحموضة 5.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 1 درجة الحموضة 6.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 1 درجة الحموضة 7.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 1 درجة الحموضة 8.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل شرط) المستخدمة في LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 2 درجة الحموضة 4.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ شاشة 2 درجة الحموضة 5.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل شرط) المستخدمة في LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ شاشة 2 درجة الحموضة 6.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 2 درجة الحموضة 7.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy & Trade ؛ الشاشة 2 درجة الحموضة 8.5</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-16LMB</td><td>طقم التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB12</td></tr><tr><td>Index & Trade ؛</td><td>مجموعة تبلور هامبتون للأبحاث</td><td>HR2-144</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX & trade ؛ 1</td><td>مجموعة تبلور هامبتون للأبحاث</td><td>HR2-107</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX & trade ؛ 2</td><td>مجموعة تبلور هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-109</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB14</td></tr><tr><td>MemStar & trade ؛</td>مجموعة <td>تبلور الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-21</td><td>(أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB15</td></tr><tr><td>MemSys & trade ؛</td>طقم <td>البلورة Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>(أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus & trade ؛ مجموعة</td> التبلور Suite <td>Qiagen</td><td>130720</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS & reg شاشة</td> مجموعة التبلور <td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB17</td></tr><tr><td>Pi الحد الأدنى</td> من الشاشة <td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في شاشة LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>مجموعة التبلور (أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل حالة) المستخدمة في LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS & reg ؛ مجموعة</td> تبلور الشاشة <td>II Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>(أنابيب الاختبار ، 10 مل لكل شرط) المستخدمة في شاشة التبلور LMB20</td></tr><tr><td>LMB والتجارة ؛</td>مجموعة تبلور <td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>(أنابيب اختبار ، 10 مل لكل حالة) تستخدم في LMB21</td></tr> <tr><td>< قوية >شاشات مضافة < / قوية ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HT شاشة مضافة</td><td>هامبتون ريسيرش</td><td>HR2-138</td><td>مجمدة في كتلة عميقة 96 بئر (1 مل لكل بئر).</td></tr><tr><td>MORPHEUS & reg; شاشة مضافة</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>مجمدة في كتلة عميقة 96 بئر (500 & micro; L لكل بئر).</td></tr><tr><td>شاشة مضافة ANGSTROM &TRADE; &nbsp;</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-100</td><td>مجمدة في كتلة عميقة 96 بئر (1 مل لكل بئر).</td></tr><tr><td>MORPHEUS & reg; شاشة مضافة</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>مجمدة في 96 بئر زراعة الخلايا Costar & reg ؛ صفيحة مع آبار على شكل حرف V (100 & micro; L لكل بئر).</td></tr><tr><td>شاشة مضافة ANGSTROM &TRADE; &nbsp;</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>MD1-100-FX</td><td>مجمدة في 96 بئر ثقافة الخلايا Costar & reg ؛ لوحة مع بئر على شكل حرف V (100 & micro; L لكل بئر).</td></tr><tr><td>شاشة إضافات أبقراط</td><td>الأبعاد الجزيئية المحدودة</td><td>n / a</td><td>48 مادة مضافة مفردة (مركبات دوائية موجودة في MORPHEUS & reg ؛ ثالثا).</td></tr><tr><td><قوية>مستهلكات أخرى< / قوية></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-جيدا MRC 2-drop لوحة</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>الجلوس قطرة، لوحة نشر البخار. حجم الخزان الموصى به: 80 &nbsp ؛ &micro;L. مجموعة من أحجام القطرات المفيدة: 10-1000 nL. الأشعة فوق البنفسجية قابلة للانتقال.</td></tr><tr><td>48-بئر MRC 1-قطرة لوحة&nbsp; ("لوحة ماكسي")</td><td>سويتشي</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>الجلوس والقطرة ، لوحة نشر البخار لتوسيع / التحسين. حجم الخزان الموصى به: 200 &nbsp; &micro;L. مجموعة من أحجام القطرات المفيدة: 0.1-10 & ميكرو ؛ L. الأشعة فوق البنفسجية قابلة للانتقال.</td></tr>ختم <tr><td>إسقاط معلق MRC</td><td>Swissci</td><td>n / a</td><td>Hunging-drop ، متوافق مع كل من لوحات نشر بخار MRC (MRC 96T-UVP و MMX01-UVP). الأشعة فوق البنفسجية والأشعة السينية قابلة للانتقال.</td></tr><tr><td>شريط ختم لاصق</td><td>هامبتون ريسيرش</td><td>HR4-50</td><td>بعرض 3 بوصات بطة & ريج. HD Clear&trade; للختم السدادة والختم اليدوي.</td></tr><tr><td>صفائح الألمنيوم اللاصقة</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>تستخدم لإعادة إغلاق الشاشات المضافة.</td></tr><tr><td>خرطوشة الحبر</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (طابعة نافثة للحبر).</td></tr><tr><td>خرطوشة المذيبات</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>النظام 1 (طابعة نافثة للحبر).</td></tr><tr><td>50 وميكرو ؛ L نصائح&nbsp;</td>نظام <td>هاميلتون</td><td>235947</td><td>2 (STAR & trade معالج السوائل). صندوق من 6 مجموعات مع 1920 × CO-RE & Trade ؛ نصائح في أكوام يمكن التخلص منها.</td></tr><tr><td>حاوية الكاشف</td><td>هاميلتون</td><td>194052</td><td>تستخدم لتوزيع حالة في لوحة (صفائح) أثناء بروتوكولات الفحص المضافة.</td></tr><tr><td>لوحة PCR</td><td>الحرارية العلمية & التجارة ؛</td><td>نظام AB-2150</td><td>2 (يحتوي على بروتين ليتم نقله إلى البعوض & reg;). Abgene Diamond ultra ، 384 بئرا على شكل حرف V.</td></tr><tr><td>المحاقن الدقيقة</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>بكرة من 26,000 حقنة صغيرة لموزع النانولتر Mosquito & reg (تباعد 9 مم).</td></tr><tr><td>كتلة حامل الشريط</td><td>جهاز TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>SSB لشرائط البعوض & reg ، المعروف أيضا باسم "حامل الكاشف رباعي الاتجاهات".</td></tr><tr><td>2 وميكرو. L 8 آبار شريط</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>يحتوي على بروتين على سطح البعوض & reg;. صندوق من 40 شريطا ، الحد الأقصى. المجلد في البئر هو 3.2 & micro ؛ L.</td></tr><tr><td>5 وميكرو ؛ شريط L 8 آبار</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>يحتوي على بروتين على سطح البعوض & reg;. صندوق من 40 شريطا ، بحد أقصى. المجلد في البئر هو 7.5 ميكرو لتر.</td></tr><tr><td>5 مل محاقن</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>جسم حقنة ومكبس لمعالج السائل Dragonfly & reg. عبوة من 100.</td></tr><tr><td>أحواض / خزانات</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>يحتوي على حلول مخزون على سطح اليعسوب & reg;. عبوة من 50.</td></tr><tr><td>شاكر الألواح الدقيقة المدارية</td><td>CamLab Limited</td><td>n / a</td><td>Variomag & reg ؛ لظروف الخلط في لوحة واحدة (0-2000 دورة في الدقيقة).</td></tr><tr><td>خلاط ميكروبليت</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. حالة الخلط في لوحة واحدة مع 96 دبوسا اهتزازيا.</td></tr></tbody></table>

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

عندما يتم الحصول على بلورات ذات جودة عالية التي ديفراكت الأشعة السينية، يمكن حلها بنية بلورية في القرب من القرار الذري. الشروط اللازمة لبلورة البروتينات والسلطات الوطنية المعينة، والكشف، وهذه المجمعات ولكن لا يمكن توقع. تستخدم مجموعة متنوعة واسعة من الظروف وسيلة لزيادة عائد بلورات حيود الجودة. وقد وضعت اثنين من أنظمة مؤتمتة بالكامل في "لجنة نهر الميكونج مختبر للبيولوجيا الجزيئية" (كامبريدج، إنكلترا، لجنة نهر الميكونج-LMB) التي تسهل فحص تبلور ضد الظروف الأولية 1,920 بنشر بخار في قطرات نانولتر. كما وضعت بروتوكولات شبه الآلي لتحسين الظروف بتغيير تركيزات الكواشف، درجة الحموضة، أو عن طريق إدخال الإضافات التي يحتمل أن تعزز خصائص البلورات الناتجة عن ذلك. سيتم وصف تفصيلي لكافة البروتوكولات المقابلة ومناقشتها بإيجاز. مجتمعة، فإنها تمكن بلورة الجزيئات ملائمة وذات كفاءة عالية في مرفق متعدد المستخدمين، بينما يعطي المستخدمين السيطرة على المعالم الرئيسية لهذه التجارب.

نظم التشغيل الآلي والبروتوكولات لإعداد عدد كبير من الشاشات الاعتيادية ونانولتر بلورة قطرات البخار نشر التجارب موصوفة ومناقشتها.

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بلورات عالية الجودة بناءً على ظروف فحص البلورة الأولية. ويمكن استخدام هذه البلورات لدراسة تراكيب البروتينات، والحمض النووي DNA، والحمض النووي الريبوزي RNA، ومعقداتها. لقد أصبح دراسة شيء ما يتعلق بالتراكيب الجزيئية الكبيرة تحدياً متزايداً.ويؤدي توفير مجموعة واسعة من الظروف الأولية إلى زيادة إنتاج البلورات المفيدة، مع تقليل الحاجة إلى تحسين العينات والبلورات. يسهل النظامان المؤتمتان بالكامل، LMB، تحضير ما يصل إلى 1,920 تجربة انتشار بخاري في قطيرات نانولترية. وللاختصار، يُفترض أن المستخدمين على دراية بالفعل بالوظائف الأساسية وصيانة موزّع النانولتر، وطابعة نفث الحبر، وجهاز ختم الأطباق اللاصق.قبل تنفيذ الإجراء، تأكد من تهيئة روبوتات النظام وفتح برنامج التحكم الخاص بها. قم بتشغيل مبرد حامل تبريد الأنابيب قبل حوالي 30 دقيقة من بدء البرنامج الرئيسي. ضع لوحة اختبار على حامل SBS الآلي الخاص بجهاز ختم الألواح.قم بتشغيل جهاز ختم الصفائح وتحقق من تطبيق الغشاء بشكل صحيح. كرر هذا الاختبار مرتين إضافيتين للتأكد من جاهزية جهاز ختم الصفائح. ثم أضف 20 liters من الماء منزوع الأيونات إلى الحاوية الرئيسية لجهاز مناولة السوائل.افصل وصلات الربط من الحاوية الصغيرة التي تحتوي على محلول شطف الإيثانول بتركيز 20%، ثم قم بتوصيل الوصلات بالحاوية الرئيسية. أدخل اسم الشاشة المناسب على شاشة اللمس الخاصة بطابعة نفث الحبر. بعد ذلك، افتح باب الكاروسيل وأغلقه لتحفيز دوران الكاروسيل.افتح الباب عندما تظهر الحزمة الأولى. قم بتحميل الحزمة الأولى بالكامل بـ 22 طبق تبلور، بحيث يكون العمود الأول في كل منها مواجهاً للخارج. قم بتحميل الحزمتين التاليتين بالكامل بنفس الطريقة.ضع الأطباق الستة المتبقية في أعلى مواضع المكدس الرابع، ثم أغلق باب الكاروسيل. تحقق من أن شاشة المبرد تشير إلى 14 درجة Celsius. اقلب أطقم الفحص المختارة برفق وبتكرار لمدة دقيقة واحدة.بعد ذلك، افتح اللوحة الأمامية لجهاز مناولة السوائل. افتح الأنابيب وضعها في حامل التبريد وفقًا للمخطط القياسي لـ 96 بئرًا. وعند وضع كل أنبوب في الحامل، ضع غطاءه على الصينية وفقًا لمخطط الـ 96 بئرًا نفسه.عند استخدام System 1، يتم وضع أسلاك الملصقات على الصينية وفقاً لتخطيط 96 بئراً لتمكين التحقق المتقاطع من ترتيب الأنابيب بشكل صحيح. تحقق من مواضع الأنابيب ثم تأكد من أن جميع الأنابيب مستوية ومستقرة في الحامل. بعد ذلك، أغلق اللوحة الأمامية.في نافذة بدء التشغيل (Startup) الخاصة ببرنامج جهاز مناولة السوائل، اختر "تشغيل الصيانة" (Run Maintenance) وافتح برنامج "الغسيل" (Flushing). قم بتشغيل البرنامج لشطف الإيثانول بتركيز 20% من النظام وغسل الأجزاء الخارجية لرؤوس توزيع السوائل. عند اكتمال عملية الغسيل، انقر فوق "إلغاء" (Cancel) للعودة إلى نافذة بدء التشغيل (Startup).اختر Run An Existing Process ثم انقر على Start Your Selection. افتح برنامج توزيع MRC Kit. أدخل "18" في خانة Instances في شاشة Configuration وقم بتشغيل البرنامج، وراقب النظام أثناء وضع الملصقات على الأطباق الأربعة الأولى وتعبئتها وإغلاقها بإحكام.لا تترك النظام دون مراقبة حتى يكتمل تحضير الأطباق الأربعة الأولى. وبمجرد تحضير جميع الأطباق البالغ عددها 72 طبقاً وإعادتها إلى الكاروسيل، قم بنقل وصلات الربط من حاوية الماء منزوع الأيونات إلى حاوية الإيثانول بتركيز 20%ethanol. قم بتشغيل برنامج شطف البدء باتباع نفس العملية السابقة.أوقف تشغيل المبرد وتخلص من أنابيب مجموعة الفحص الفارغة. قم بإزالة الأطباق الـ 72 التي تم تحضيرها من القرص الدوار بعناية. تخلص من الأطباق التي تم ملؤها بشكل غير صحيح أو التي تمت ختمها بشكل رديء.تُحفظ الأطباق الجاهزة للاستخدام عند درجة حرارة 10 degrees Celsius. أولاً، تأكد من تشغيل روبوتات النظام، وتهيئة موزع النانولتر مع فتح البرنامج الخاص به، وفتح مدير الطرق الخاص بجهاز مناولة السوائل. قم بتشغيل حامل تبريد الأنابيب الدقيقة قبل حوالي 15 دقيقة من بدء البرنامج الرئيسي.ضع لوحة اختبار على الحامل الآلي SBS الخاص بجهاز ختم الأطباق. قم بتشغيل جهاز ختم الأطباق وتحقق من أن اللوحة قد تم ختمها بشكل صحيح. اختبر جهاز ختم الأطباق ثلاث مرات.بعد ذلك، قم بتشغيل موزع النانولتر لوضع قطرات بحجم 100 nanoliter من محلول الاختبار في طبق اختبار. يظهر هنا مجهر ضوئي لقطرة بحجم 100 nanoliter، أنتجها موزع النانولتر، حيث تم تحضير محلول الاختبار باستخدام صبغة حمراء. أغلق برنامج موزع النانولتر وقم بإزالة كتلة حامل الشرائح من المنصة.بعد ذلك، ضع في حامل أطباق مصمم خصيصاً طبق بلورة مكون من 96 بئراً مملوءاً مسبقاً، بحيث يحتوي على أعلى كمية نسبية من الكواشف المتطايرة ضمن ظروفه. قم بإزالة الغشاء اللاصق من الطبق. افتح اللوحة الأمامية لجهاز مناولة السوائل، وضع الطبق غير المختوم على المنصة في الجزء الخلفي من الحامل المنزلق الأول.قم بتغطية الطبق بغطاء ألومنيوم من شركة SBS. قم بتثبيت الغطاء باتجاه الزاوية الخلفية اليسرى من الحامل من خلال تطبيق ضغط خفيف على الزاوية المقابلة للغطاء. عند استخدام System 2، يجب معالجة أطقم الفحص التي تحتوي على كميات كبيرة من الكواشف المتطايرة أولاً.يمنع ذلك تكثف الرطوبة على وصلات SBS، الأمر الذي قد يؤثر على المناولة الآلية للوصلات أو إغلاق الأطباق. قم بإزالة الغطاء، وتحميل الحوامل المنزلقة، وتغطية الأطباق الـ 19 المتبقية بنفس الطريقة، مع العمل من الظروف الأكثر تطايرًا إلى الأقل تطايرًا. بمجرد وصول حامل تبريد الأنابيب الدقيقة إلى 4 degrees Celsius، كما يشير الضوء الأخضر، قم بإزالة غطائه.اقطع غطاء أنبوب دقيق يحتوي على 440 µL على الأقل من عينة بروتينية. تأكد من عدم وجود رغوة فوق السطح الهلالي للعينة، لأن ذلك سيتداخل مع نظام الكشف عن السوائل. ضع الأنبوب في الموضع 1 من حامل تبريد الأنابيب الدقيقة.ضع لوحة PCR على منصة جهاز مناولة السوائل أمام حامل محول تحريك اللوحات. ثم أغلق اللوحة الأمامية. في واجهة إدارة طرق مناولة السوائل، اختر إعداد اللوحات (Setup Plates).راقب عملية تهيئة كلا النظامين وقم بتعبئة معايير التشغيل، بما في ذلك نوع الطبق وعدد القطرات لكل حالة، وحجم القطرة، وموضع أول طبق سيتم معالجته، وعدد الأطباق. انقر على "لا" عندما يُسأل عما إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة في تحميل المنصة. وبمجرد التحقق من عدم وجود حاملات رؤوس فارغة، انقر على "موافق". وبمجرد التحقق من وجود رؤوس كافية لعملية التشغيل، انقر على "موافق". وعند الضرورة، قم بتحديث نظام إدارة الرؤوس وانقر على "موافق". تأكد من أن منصة موزع النانولتر خالية من كتلة حامل الشرائح، وأن الحامل موجود في الجزء الخلفي من مجموعات الرؤوس سعة 50 microliter، وأنها خالية من أغطية SBS الألومنيوم.تحقق مرة أخرى من جاهزية جميع المكونات الأخرى المطلوبة ثم ابدأ العملية. راقب النظام أثناء قيام موزع النانوليتر بوضع القطرات في اللوحة الأولى، ثم قيام جهاز ختم اللوحات بختم اللوحة لاحقاً. لا تترك النظام دون مراقبة حتى يكتمل تحضير اللوحة الأولى.بمجرد تحضير جميع الأطباق العشرين بقطرات التبلور وعودتها تلقائياً إلى الحوامل المنزلقة، افتح اللوحة الأمامية وأخرج الأطباق برفق. تحقق من إحكام غلق الأطباق بشكل صحيح قبل تخزينها لعملية التبلور. نظف أغطية SBS بمحلول ethanol بتركيز 20% قبل تكديسها على الجانب الأيسر من جهاز مناولة السوائل للتخزين.تخلص من صفيحة PCR والأنبوب الدقيق. أوقف تشغيل حامل تبريد الأنابيب الدقيقة وامسح التكثف. ضع منشفة ورقية فوق سطح المبرد لامتصاص أي تكثف إضافي.بعد ذلك، استبدل غطاء الحامل وأغلق اللوحة الأمامية. تم فحص OmpF و MreB في البداية باستخدام هذه البروتوكولات المؤتمتة بالكامل. وُجدت بلورات OmpF ذات جودة كافية لحيود الأشعة السينية في البئر A4 من لوحة LMB 7.تم العثور على بلورات MreB ذات جودة حيود في البئر D12 من لوحة LMB 20. يعد تخزين لوحات ما قبل التغذية في درجة حرارة 10 degrees Celsius حلاً وسطاً لتجنب التجميد والتخزين في درجة حرارة 4 degrees، والذي قد يؤدي إلى تدهور ظروف البلورة ومشاكل متعلقة بالتكثيف. عند التخزين بهذه الطريقة، يمكن استخدام اللوحات في غضون أربعة إلى خمسة أشهر.يتم إنتاج ما بين 4,000 و8,000 طبق LMB سنوياً باستخدام System 1، وتُستخدم لاحقاً في عملية الفرز الأولي. يجب تحسين البروتوكولات بشكل مختلف عندما يكون معدل الإنتاج المتوقع أقل بكثير. عادةً ما تُستخدم مجموعتنا الكاملة من أطباق ما قبل التزويد بالوقود كفحص أولي واسع النطاق لعينة جديدة.ومع ذلك، قد يتم اختيار عدد أقل من الأطباق وفقاً لمتطلبات عينات محددة للغاية. وبعد تحضير القطيرات، تُخزن الأطباق على أرفف منخفضة الاهتزاز مع تحكم دقيق في درجة الحرارة عند 4 أو 18 درجة Celsius. وتُقيَّم التجارب باستخدام مجاهر ذات مصدر ضوء لولبي.بعد استقصاء طبيعة البلورات بعناية، يمكن تحليل السمات وأوجه التشابه عبر الظروف المختلفة باستخدام أدوات قائمة على الويب مثل قواعد بيانات LMB أو C6 Screen. وقد تظل عملية التحسين اللاحقة لظروف البلورة ضرورية. كما تم وصف بروتوكولات مؤتمتة إضافية، تشمل طرق الزوايا الأربع (4-corner methods) وفحص المواد المضافة، في مخطوطتنا البحثية.

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هيكل 3 - D من جزيء يوفر فريدة من فهم كيفية عمل الجزيء. الأسلوب الرئيسي للتقرير في بنية شبه الذرية القرار البلورات بالأشعة السينية. هنا ، علينا أن نظهر أن الأساليب الحالية للحصول على بلورات ثلاثي الأبعاد للجزيء أي بالنظر إلى أن تكون مناسبة لتحديد الهيكل بواسطة البلورات بالأشعة السينية.

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

يوصف هنا نهج الروبوتية إلى الإنتاجية العالية بلورة البروتينات الغشاء في mesophases شحمي لاستخدامها في تصميم هيكل الجزيئات باستخدام الأشعة السينية البلورات. وقدم ثلاثة روبوتات قادرة على التعامل مع لزجة لزجة والبروتين لادن mesophase جزءا لا يتجزأ من أسلوب.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

وهنا، نحن تصف كيفية استخدام الفرز الآلي وخيارات جمع البيانات المتاحة في بعض بيملينيس السنكروتروني. العلماء إرسال عينات كريوكوليد إلى السنكروتروني، ويتم فحص خصائص الحيود ومجموعات البيانات التي تم جمعها ومعالجتها و، حيثما أمكن، حل هيكل ينفذ — كل ذلك دون تدخل بشري.

توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

يتم تقديم حامل عينة جديد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع بروتوكول التعامل المناسب. يسمح النظام بنمو البلورات، ونقع الكريستال وجمع بيانات الانعراج في الموقع في كل من درجة الحرارة المحيطة والمبردة دون الحاجة إلى أي تلاعب بالكريستال أو التركيب.

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

تتطلب الدراسات الهيكلية للجزيئات الحيوية بواسطة البلورات بلورات عالية الجودة. هنا نبرهن على بروتوكول يمكن استخدامه من قبل OptiCrys (أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا) و / أو أزرار التحليل الدقيق لزراعة بلورات كبيرة عالية الجودة استنادًا إلى معرفة الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور.

تحسين النمو البلوري للبلورات النيوترونية الجزيئية

نسبة الإشارة إلى الضوضاء من البيانات هي واحدة من أهم الاعتبارات في إجراء قياسات الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يوفر خط الحزم VMXm بيئة منخفضة الضوضاء والميكروبات لمثل هذه التجارب. هنا، ونحن نصف أساليب إعداد عينة لتركيب وتبريد البلورات الدقيقة لVMXm وغيرها من الخطوط شعاعية البلورات الجزيئية الدقيقة.

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

هنا، ونحن نصف كيفية استخدام خطوط أنابيب البلورات الجزيئية الكلية الآلي للبروتين إلى هيكل، وتحليل مجمع البروتين ليغاندي السريع وفحص جزء على نطاق واسع على أساس التكنولوجيا CrystalDirect في مختبر HTX في EMBL غرونوبل.

خطوط أنابيب البلورات الآلية في مرفق EMBL HTX في غرونوبل

يفصل هذا البروتوكول فحص التبلور عالي الإنتاجية ، بدءا من إعداد لوحة المقايسة الدقيقة 1,536 إلى نهاية نافذة زمنية تجريبية مدتها 6 أسابيع. يتم تضمين تفاصيل حول إعداد العينة ، والتصوير الذي تم الحصول عليه ، وكيف يمكن للمستخدمين إجراء التحليلات باستخدام واجهة مستخدم رسومية مدعومة بالذكاء الاصطناعي لتحديد ظروف التبلور الجزيئي بسرعة وكفاءة.

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

نقدم بروتوكولا لتبلور البروتينات باستخدام مرفق التبلور في مجمع الأبحاث في هارويل وما بعده من جمع بيانات البلورات بالأشعة السينية في الموقع من البلورات داخل الألواح في خط شعاع دايموند متعدد الاستخدامات للجزيئات الكبيرة في الموقع (VMXi). نحن نصف متطلبات العينة وبروتوكولات التبلور وإرشادات جمع البيانات.

التبلور وجمع بيانات درجة حرارة الغرفة في الموقع باستخدام مرفق التبلور في Harwell و Beamline VMXi ، مصدر ضوء الماس

تعلم بروتوكولات التبلور الآلية لإعداد بلورات عالية الجودة من البروتينات والحمض النووي باستخدام أنظمة التبخير النانولترية. هذه الطريقة تُسرّع دراسات البيولوجيا الهيكلية وتُحسّن إنتاجية التجارب بشكل كبير.

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

استكشف المزيد من الفيديوهات