استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

الهدف العام من إجراءات الوسم هذه هو تصوير وقياس كمية الأنابيب الدقيقة المستقرة والديناميكية والناشئة في جنين سمكة الزيبرا النامي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا العصبية التنموية، مثل كيفية مساهمة الأنابيب الدقيقة في تأسيس قطبية الخلية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تحسن من عملية الكشف عن مجموعات الأنابيب الدقيقة المتميزة وقياس كميتها في الموقع.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات بسبب التحديات المتعلقة بالحفاظ على سلامة الأنيبيبات الدقيقة. بعد إزالة الكلور من أجنة zebrafish في مراحل نموها وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم نقلها إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter، مع إزالة أكبر قدر ممكن من الوسط. أضف one milliliter من 4%PFA في محلول منظم تجميع الأنيبيبات الدقيقة (MAB)، لتثبيت الأجنة عند 28.5 degree celsius لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، استخدم ماصة لسحب المثبت واستبداله بـ 1 ml من مثبت جديد. قم بتحضين العينات على هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. اسحب المثبت وأضف 1 ml من محلول TBS NP-40 المنظم.

قم برج الأجنّة بلطف على جهاز هزاز (rocker) لمدة خمس دقائق. كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين. بعد ذلك، استبدل المحلول المنظم بـ 1 mL من محلول TBS NP-40 الطازج، ثم احفظ الأجنّة عند درجة حرارة 4 °C لمدة لا تتجاوز سبعة أيام.

بعد إزالة المح، وتضمين الأجنة في الآغاروز وفقاً للبروتوكول النصي، ضع طبق التقطيع المملوء بـ TBS NP-40، واستخدم المقطاع الاهتزازي (vibratome) لعمل قطاعات بسمك 40 micrometers من أطول محور للأجنة المضمنة في الآغاروز. استخدم ملاقط دقيقة لنقل القطاعات المطلوبة إلى 500 microliters من TBS NP-40 في طبق يحتوي على 24 بئراً. قم بإزالة المحلول المنظم، وأضف 500 microliters من محلول الحجب.

ثم قم بهز المقاطع في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. استبدل محلول الحجب بـ 300 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب، وقم بحضن العينات على هزاز عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من 36 إلى 72 ساعة. استخدم 600 µL من TBS NP-40 لغسل العينات مرتين.

ضعها على هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لكل منها. أضف 300 µL من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بفلوروفور والمخففة في محلول حجب إلى المقاطع، ثم حضنها في الظلام على هزاز عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. بعد ذلك، اغسل العينات مرتين كما تم توضيحه للتو.

بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول DAPI إلى الأجنة واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم TBS NP-40 لغسل العينات ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وعقب عمليات الغسل، ضع قطرة من وسط التثبيت المحتوي على عامل مضاد للتلاشي في مركز شريحة زجاجية خالية من الغبار.

استخدم ملقطاً دقيقاً لنقل المقاطع إلى قطرة وسط التثبيت. ثم ضع غطاء شريحة خالياً من الغبار فوق العينة. تُحفظ الشرائح ملفوفة بورق القصدير، في مكان جاف ومظلم وبارد حتى يتم إجراء التصوير.

باستخدام التفاصيل الموضحة في البروتوكول المكتوب، التقط صوراً مجهرية بؤرية (confocal) بنظام z stack مع ضبط إعدادات القنوات لفلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية المختارة، ثم احفظ ملفات الصور. وباستخدام برنامج تحليل ثلاثي الأبعاد مثل Image J، افتح نسخة من ملف البيانات. ثم أنشئ صورة مدمجة عن طريق تراكب القنوات المطلوبة من خلال اختيار image، ثم color، ثم merge channels.

حدد القنوات 594 nanometer و488 nanometer وDAPI ليتم تلوينها بالأحمر والأخضر والأزرق على التوالي. قم بالتأشير، ثم أنشئ صورة مركبة واضغط على "موافق". قم بتصور مكدس Z المدمج كصورة 2D واحدة عن طريق إجراء إسقاطات الكثافة القصوى لمكدس Z باستخدام "images"، ثم "stack"، ثم "z project".

أدخل مواضع البداية والنهاية لأفضل مستويات z الداخلية كشريحة بداية وشريحة نهاية على التوالي. اختر "max intensity" كنوع للإسقاط ثم انقر موافق. في برنامج التحليل ثلاثي الأبعاد، اختر "create library" ثم ضع اسماً وصفياً لمكتبة الصور.

انقر وقم بإنشاء وسحب ملفات الصور الخام إلى المكتبة. بعد ذلك، اختر ملفاً لتحليله. ثم، من قائمة العرض، اختر التركيز الممتد (extended focus) لعرض الصورة المدمجة للقنوات في النافذة الرئيسية.

اختر أداة تحديد منطقة الاهتمام (ROI) باليد الحرة، ثم حدد المنطقة المراد تحليلها. اختر علامة تبويب الإجراءات (actions)، ثم اختر "قص حسب التحديد" (crop to selection) لقص الصورة. بعد ذلك، احفظ ملف الصورة المقصوصة باسم جديد.

بعد ذلك، انقر فوق علامة تبويب القياسات (measurements) لإنشاء البروتوكول الخاص بتصفية كائنات محددة ذات صلة بالتحليل ثلاثي الأبعاد. ثم قم بسحب "البحث عن الكائنات" (find objects) إلى نافذة البروتوكول وأعد تسمية البروتوكول الأول باسم DAPI. اختر قناة beta tubulin من القائمة المنسدلة.

بعد ذلك، قم بسحب الإعدادات التالية إلى بروتوكول beta tubulin وضعها أسفل "find objects" بالترتيب التالي: "Fill holes and objects"، و"separate touching objects"، و"exclude objects by size"، و"exclude not touching ROIs". الآن، اختر "measure" في أسفل كل بروتوكول.

بعد ذلك، لجميع القنوات باستثناء DAPI، اختر قياس الكثافة والحجم والطول الهيكلي لجميع واسمات tubulin. ارسم منطقة اهتمام (ROI) حول المنطقة المراد قياسها. وتحت علامة تبويب الملخص، لاحظ القياسات بعد أن يقوم البرنامج بمعالجة المنطقة.

بعد ذلك، قم بنسخ البيانات وحفظها في جدول بيانات قابل للتعديل كما هو موضح هنا. ولإنشاء جهاز تدفق متعدد الفتحات، استخدم مثبتًا أو منشارًا شريطيًا لشق أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter إلى نصفين طوليين. ومن شبكة نايلون بقطر 70 micrometer، قص سبعة أنصاف دوائر بنصف قطر قدره ثلاثة سنتيمترات وقم بتقليمها لتناسب إحكامًا أحد نصفي أنبوب الطرد المركزي المشقوق.

باستخدام مادة مانعة للتسرب من السيليكون آمنة لأحواض السمك، قم بلصق أنصاف الدوائر داخل أنبوب الطرد المركزي بحيث تكون موازية لعلامات التدرج الخاصة بـ 10 milliliter. بعد ترك الجهاز ليجف لمدة يومين، اشطفه عن طريق نقعه في بيكر يحتوي على الماء لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات. قم بتغطية النهاية العلوية المسننة لأنبوب الطرد المركزي المقطوع باستخدام طين النمذجة، بحيث يكون عمق السائل المتبقي في جهاز التدفق ربع بوصة.

قم بتجهيز جهاز الغسل عن طريق إزالة المكبس من حقنة سعة 50 milliliter وإدخال أنبوب رفيع بطول 12 inches في الطرف. ادفع الأنبوب إلى أقصى حد ممكن واستخدم صلصال النمذجة لإحكام الغلق حول الوصلة. قم بترطيب الشبكة مسبقاً باستخدام وسط الأجنة للسماح للسائل بالتدفق عبر جهاز التدفق بالكامل.

قم بإمالة الجهاز على الثلج بحيث يسحب السائل في جميع المقصورات، مع الاستمرار في تفريغه من الجهة الأمامية حيث توجد الحافة الطينية. قم بتعليق جهاز الغسل على حامل حلقي فوق جهاز التدفق الموجود على الثلج. قم بتبريد 200 milliliters من وسط الأجنة على الثلج، وصب كمية كافية في جهاز الغسل لضمان إزالة جميع الفقاعات الهوائية وأن يكون معدل التدفق حوالي سبعة milliliters في الدقيقة.

اضبط معدل التدفق عن طريق تغيير ارتفاع المحقنة. بعد إزالة الكلور من الأجنة وتحضير النوكودازول وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم 10 milliliters من محلول النوكودازول التشغيلي البارد لاستبدال وسط الأجنة لمجموعة علاج النوكودازول. ضع أطباق بتري على الثلج لفترة زمنية مناسبة للمرحلة التنموية.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة زجاجية سعة 1 مل مصقولة باللهب، انقل الأجنة إلى جهاز التدفق المستمر باستخدام حجرات منفصلة لكل مجموعة تجريبية. ابدأ عملية غسل النوكودازول (nocodazole) بسكب وسط أجنة مبرد بالثلج في الجزء العلوي من محقنة سعة 50 مل. اسمح للأنيبيبات الدقيقة بالنمو مجدداً بعد 20 دقيقة من الغسل في درجة حرارة الغرفة، وذلك باستخدام ماصة زجاجية سعة 1 مل مصقولة باللهب لنقل الأجنة إلى أطباق بتري زجاجية تحتوي على وسط أجنة دافئ.

بمجرد نقل الأجنّة، ابدأ بتشغيل المؤقت. وأخيرًا، قم بتثبيت أجنّة المجموعة الضابطة وأجنّة مرحلة الغسل عند الدقيقة الأولى والخامسة والعاشرة، وذلك عن طريق نقل ما يقرب من 10 أجنّة باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter مملوء بـ 1 milliliter من مثبت 4%PFA MAB، ثم ثبت العينات كما تم توضيحه سابقًا في هذا الفيديو. استخدم glu-tubulin و tyr tubulin كعلامات للأنيبيبات الدقيقة المستقرة والديناميكية.

تظهر الأنابيب الدقيقة الديناميكية بأنها سائدة في الدماغ الخلفي في مرحلة القلعة العصبية. ومع تطور القلعة إلى القضيب العصبي، وهي مرحلة تتميز بتعزيز التظهير، يقل عدد الأنابيب الدقيقة ذات التفاعل المناعي مع جسم مضاد anti tyr-tubulin نوعياً، لا سيما في القضيب البطني. وفي المقابل، يتوزع glu-tubulin بشكل مبعثر ونقطي في جميع أنحاء القلعة العصبية، ولكنه يتركز في القضيب العصبي البطني على طول مسار الأنابيب الدقيقة.

تشير رؤوس الأسهم إلى حزم أو تراكيب أنبوبية دقيقة محددة تزداد فيها عملية الوسم. يؤدي العلاج بـ nocodazole إلى إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة، مما ينتج عنه وسم منتشر. ومع إعادة نمو الأنابيب الدقيقة، فإنها تمتد من الجسيم المركزي.

ومع ذلك، قد لا يكون هذا واضحاً في مستوى واحد بسبب مساراتها غير المستوية. ومع ذلك، فإن بعض برامج تحليل الصور قادرة على قياس الأطوال في الأبعاد الثلاثية 3D، مما يسمح بتقييم نمو الأنيبيبات الدقيقة بعد غسل النوكودازول. ويبدو أن متوسط طول الأنيبيبات الدقيقة يزداد بمرور الوقت بعد غسل النوكودازول في جميع مناطق الأنبوب العصبي التي تم تحليلها.

بمجرد الانتهاء من تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد والتحقق من ضبط الجودة، يمكن استخلاص معلومات مفيدة من البيانات الخام، مثل متوسط الطول الإجمالي للأنيبيبات الدقيقة والأنيبيبات الدقيقة المستقرة، بالإضافة إلى نسبة الأنيبيبات الدقيقة المستقرة إلى إجمالي الأنيبيبات الدقيقة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، فإنها لا تستغرق أكثر من أسبوع من البداية وحتى النهاية. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر جمع العينات ومعالجتها في الوقت المناسب لأن الأنيبيبات الدقيقة تفقد بلمرتها بسهولة.

يمكن تطبيق هذا الإجراء أيضاً على تحليل الطفرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية التقاط مجموعات متميزة من الأنيبيبات الدقيقة في الجنين السليم.