الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم منهجيات علم البلورات بالأشعة السينية المطبقة على البلورات الدقيقة، وبوجه خاص تلك التي يتم إنتاجها داخل الخلايا والتي تُعتبر بلورات في الجسم الحي (in vivo). وتكمن الميزة الرئيسية لهذا النهج في توفيره لعملية بسيطة وفعالة لإنتاج البلورات الدقيقة والكشف عنها وتحليلها. تهدف هذه الطريقة إلى تسهيل استخدام البلورات الدقيقة من خلال الاستعانة بالبلورات التي تنمو داخل الخلايا الحية، مما يلغي الحاجة إلى عمليات تنقية معقدة وتجارب ترسيب Aprocox.

سنركز في هذا الفيديو على إجراءات التحضير والمناولة البسيطة لتجارب انحراف الأشعة السينية في خط شعاع السينكروترون. وسنستعرض الخطوات التي تختلف بشكل كبير عن علم البلورات الكلاسيكي. سنستخدم في هذا العرض البلورات المستمدة من بروتين polyhedron الحيوي والتي تم إنماؤها بنجاح، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على البروتينات التي تشكل بلورات في أي خلايا بكتيرية أو حشرية أو ثديية أو خلايا خميرة.

أولاً، يتم تحضين 30 ملليلتر من خلايا Sf9 التي تفرط في التعبير عن بروتين polyhedron للفيروس المتعدد السطوح (cypovirus) لمدة ثلاثة أيام عند درجة حرارة 27 درجة مئوية على منصة دوارة. انقل 500 ميكرولتر من مزرعة خلايا Sf9 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة سيرولوجية معقمة، مع الحرص على ضمان الحفاظ على تعقيم المزرعة الرئيسية من خلال استخدام كابينة سلامة حيوية من الفئة الثانية واتباع تقنيات التعقيم القياسية. اسحب خمس ميكرولتر من الخلايا من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وضعها على شريحة زجاجية.

بعد ذلك، قم بإمالة غطاء شريحة زجاجي برفق فوق العينة بحيث تلامس إحدى حواف الغطاء القطرة، ثم أنزل الغطاء بعناية فوق السائل، مع تجنب تكوين فقاعات هوائية. بعد ذلك، قم بتصوير الشريحة باستخدام مجهر مقلوب. افحص الخلايا بدقة، بدءاً من تكبير 200x، ثم قم بالتكبير إلى أقصى درجة عند اكتشاف بلورة محتملة.

ابحث عن الحواف الحادة والتغيرات في الانكسار الضوئي. في حال تحديد وجود بلورات، افحص المزرعة يومياً لمراقبة نمو البلورات من خلال تكرار الخطوات السابقة. بالنسبة لخلايا Sf9، قم بحصادها عن طريق نقل المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي.

ضع الأنبوب على الثلج وانتقل إلى الخطوة التالية في أسرع وقت ممكن. لعزل الخلايا المحتوية على البلورات، اسحب بالماصة أربعة ملليلتر من خلايا Sf9 المصابة في أنبوب مخصص لتحليل قياس التدفق الخلوي. جهز أنبوباً ثانياً يحتوي على عدد مكافئ من خلايا Sf9 من مزرعة محاكة الإصابة (mock infected) لتكون بمثابة عينة ضابطة.

بعد ذلك، أضف يوديد البروبيديوم إلى كلتا العينتين ليصل التركيز النهائي إلى 1 µg/mL، وذلك مباشرة قبل التقييم باستخدام قياس التدفق الخلوي. الآن، ضع خلايا العينة الضابطة في جهاز قياس التدفق الخلوي القياسي القادر على فرز الخلايا وفقاً لـ FSC وSSC. قم بتحليل ما لا يقل عن 20,000 حدث.

بعد استبعاد الخلايا الميتة، وتجمعات الخلايا، والحطام من التحليل، قم بإنشاء مخطط FSC مقابل SSC. بعد ذلك، قم بتحليل ما لا يقل عن 20,000 حدث من العينة التي تحتوي على البلورات. قارن مخطط FSC مقابل SSC مع عينة التحكم وابحث عن ظهور مجموعة متميزة تقابل الخلايا المحتوية على البلورات.

حدد البوابات حول مجموعة الخلايا التي تحتوي على البلورات، والتي تظهر عادةً عند قيم SSC أو FSC أعلى. وباستخدام هذا التحديد، قم بفرز ما يقرب من 150,000 إلى 200,000 من الخلايا التي تحتوي على البلورات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter مملوء مسبقاً بـ 50 microliters من محلول PBS المنظم. قم بتصوير العينات المفرزة باستخدام المجهر الضوئي كما تم وصفه سابقاً للتأكيد على المجموعة المرتبطة بالخلايا التي تحتوي على البلورات.

في هذه المرحلة، يمكن تحضين الخلايا مع محاليل الذرات الثقيلة إذا كان تحديد الطور التجريبي مطلوباً. يتبع هذا النهج عملية فحص لمركبات وأوقات تحضين متنوعة كما هو موضح في النص وفي مراجعات أخرى. قم بتجهيز أدوات تثبيت العينة عن طريق إرفاق شبكة دقيقة مثبتة على دبوس بنهاية عصا مغناطيسية أولاً.

ضع العصا جانبياً في شق عوامة ديالزة. ثم، التقط فتيلة ورقية باستخدام ملقط وثبتهما. تحقق مرة أخرى من اكتمال الإعداد قبل المتابعة.

الآن، اخلط الخلايا مع حجم مساوٍ من محلول trypan blue بتركيز 0.4% للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.2%. بعد إعادة تعليق الخلايا، انقل 0.5 µL من الخلايا المفروزة باستخدام الماصة إلى الشبكة الدقيقة (micro mesh). بعد السماح للخلايا بالترسب على سطح الشبكة الدقيقة، قم بإزالة معظم السائل الزائد عن طريق التجفيف بفتيلة ورقية. إذا لم يتم تجفيف الشبكة الدقيقة بشكل كافٍ، ستكون الخلايا على أعماق مختلفة داخل السائل الزائد، مما سيعقد عملية محاذاتها مع شعاع الأشعة السينية في السنكروترون.

بالإضافة إلى ذلك، فإن السائل الزائد سيزيد من تشتت الأشعة السينية في الخلفية. وإذا تم تجفيف الشبكة الدقيقة بشكل مفرط، فسيتم إزالة السائل تماماً ولن تثبت العينة في فتحات الشبكة. أما عند التجفيف الأمثل، فتتبقى طبقة رقيقة فقط من السائل على الشبكة الدقيقة، مما يحمي العينة ويدفعها نحو فتحات الشبكة.

ستتطلب بعض البلورات استخدام مادة واقية من التجمد. هذا الأمر غير مطلوب في حالتنا، ولكن الإجراء سيكون مشابهًا لعملية تطبيق العينة ثم التجفيف بالامتصاص. تأكد من بقاء طبقة رقيقة فقط من السائل.

قم بتبريد الشبكة الدقيقة فوراً بالتجميد السريع في النيتروجين السائل، ثم انقلها إلى قرص آلي لنقلها إلى خط شعاعي بؤري دقيق في السنكروترون. ونظراً للحجم الصغير للبلورات داخل الجسم الحي، قم بجمع بيانات الحيود على خط شعاعي لبلورات بؤري دقيق. أولاً، قم بتثبيت الشبكة الدقيقة على مقياس الزوايا (goniometer).

الآن، ابدأ بتوسيط الشبكة الدقيقة (micro mesh) مع مسار الحزمة باستخدام التوجهات المواجهة والجانبية. ومعما تكون الشبكة الدقيقة في وضعية المواجهة، قم بضبط المحاذاة بدقة من خلال محاذاة مركز أحد المسارات الأفقية للشبكة الدقيقة. اجمع البيانات على طول هذا المسار الأفقي مع إجراء تعديلات طفيفة فقط على المحاذاة.

بمجرد اختبار جميع البلورات في المسار، انتقل إلى المسار التالي وكرر إجراء المحاذاة. تأكد من تحديد المسارات التي تمت معالجتها بوضوح لتجنب تفويت أي بلورات أو تصويرها مرتين، مع الاسترشاد بتغير اللون الناتج عن صبغة trypan blue. يتم تقديم نظرة عامة على طريقتين لتحديد البنية باستخدام البلورات الدقيقة في الجسم الحي (in vivo).

يصف الصف العلوي النهج الكلاسيكي الذي يتضمن تنقية البلورات من الخلايا، بينما يوضح الصف السفلي نهج علم البلورات داخل الخلية (in cellulo crystallography) الذي يبقي البلورات داخل الخلايا المضيفة لجمع البيانات. وبالنسبة لنهج داخل الخلية، يتمت مقارنة ملف التدفق الخلوي للخلايا غير المصابة بملف الخلايا التي تحتوي على بلورات، ويُستخدم ذلك لتحديد مجتمع الخلايا الذي يجب اختياره لفرز الخلايا التي تحتوي على بلورات وفصلها عن الخلايا الأخرى. وفي هذا المثال، تظهر الخلايا التي تحتوي على أجسام متعددة السطوح (polyhedra) تشتتاً جانبياً أعلى من الخلايا غير المصابة.

يمكن رؤية الخلايا المصبوغة بـ trypan blue بسهولة باستخدام الكاميرات المتاحة في معظم خطوط الحزم في السنكروترون. وبينما يتطلب تحديد البلورات المنقاة ومحاذاتها مع شعاع X-ray جهداً كبيراً بسبب صغر حجمها، فمن الأفضل عند جمع البيانات المتابعة وفق نمط شبكي لتقليل إجراءات التمركز وتجنب تعريض الخلية أو البلورة نفسها مرتين أو تفويت الخلايا والبلورات. وبمجرد إتقان هذه العملية، فإن هذا المسار يستغرق حوالي نصف يوم بدءاً من حصاد الخلايا التي تحتوي على بلورات وصولاً إلى جمع البيانات.

يتوافق هذا الإجراء مع عمليات نقع الذرات الثقيلة لغرض تحديد الطور التجريبي. وفي حالة متعدد السطوح، تم الحصول على البنية الطبيعية في غضون ثمانية أيام من بدء التعبير البروتيني. لا تنسَ أن العمل بالنيتروجين السائل يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الاختناق والحروق.