نقص الأكسجين المسبق للخلية السلف المستمدة من نخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة
يونيو 14, 2017
خلايا انسجة النخاع (مسس) مع وجود إمكانات عصبية داخل نخاع العظم. بروتوكول لدينا يثري هذه المجموعة من الخلايا عن طريق مسبق نقص الأكسجين، وبعد ذلك يوجه لهم لتصبح خلايا شوان ناضجة.
الهدف العام من تقنية زراعة الخلايا هذه هو إثراء الأسلاف العصبية لنخاع العظام لتسهيل تمايزها إلى خلايا شوان الوظيفية. تعالج هذه الطريقة مشكلة رئيسية في الخلايا الجذعية والطب التجديدي: كيفية استخدام مصدر محدود من الأسلاف العصبية لتوليد الخلايا الدبقية للمساعدة في إعادة نمو المحور العصبي بعد الصدمة وإعادة تكوين الميالين. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية في استخدام تكييف الثقافة الفعال لتسهيل تمدد الخلايا العصبية من الخلايا اللحمية لنخاع العظام لاستخدامها في العلاج بالخلايا الذاتية.
بعد يومين في المزرعة ، قم بإزالة 75٪ من الوسط المستهلك والخلايا غير الملتصقة واشطف الخلايا الملتصقة بثلاث غسلات PBS مقاس 10 ملم. بعد الغسيل الثالث ، استبدل PBS ب 10 ملليلتر من الخلايا الفغرية في النخاع ، أو MSC ، وسط النمو وأعد المزرعة إلى الحاضنة. يجب أن تظهر المستعمرات المرئية في اليوم السادس إلى السابع.
في اليوم 10 ، اغسل المزرعة في PBS الطازج وافصل الخلايا ب 1.5 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية المؤتلف. بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط نمو MSC لتحييد التفاعل وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط نمو MSC الطازج وبذر الخلايا بأربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في صفيحة زراعة أنسجة جديدة 10 سم.
يجب أن تصل التقاء الخلايا إلى 80 إلى 90٪ في غضون يومين من المرور. للتكييف المسبق لنقص الأكسجين ، حرر المشبك الدائري أولا ونظف الأجزاء المكشوفة بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتفكيك غرفة نقص الأكسجة إلى مكونات ووضعها في غطاء تدفق رقائقي للتعقيم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، اغسل 80 إلى 90٪ مزرعة MSC ملتصقة مع 10 ملليلتر من PBS كما هو موضح للتو وعالج الثقافات بوسط نمو MSC طازج مكمل ب 25 مليمول. ضع المزرعة المعالجة في غرفة نقص الأكسجة المعاد تجميعها وشد المشبك الحلقي. أغلق طرفي التوصيل للغرفة للتأكد من عدم وجود تسرب للغاز وقم بغسل خليط غاز مكون من 99٪ نيتروجين و 1٪ أكسجين في الغرفة بمعدل تدفق 10 لترات في الدقيقة.
بعد خمس دقائق ، ضع الغرفة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 16 ساعة. في صباح اليوم التالي ، افصل الخلايا كما هو موضح للتو واجمعها عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في وسط السلف العصبي وقم بالبذور ستة أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع على 6 ألواح آبار منخفضة التعلق لزراعتها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 12 يوما.
يجب ملاحظة مجالات كبيرة غير ملتصقة من الخلايا بحلول اليوم السادس إلى السابع. مع ظهور المزيد من المجالات العصبية في الثقافات المكيفة لنقص الأكسجة أكثر من تلك الموجودة تحت نورموكسيا في الأيام من 10 إلى 12. في اليوم 12 ، استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل المجالات العصبية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجمع المجالات العصبية عن طريق الطرد المركزي.
أعد تعليق المجالات في DMEM / F12 ولوحة من خمسة إلى 10 مجالات عصبية لكل سنتيمتر مربع على 6 ألواح آبار مطلية ب poly-D-lysine laminin في 1.5 مل من وسط الحث الدبقي لكل بئر. حافظ على ثقافة الخلايا الكروية لمدة سبعة أيام على الأقل ، مع تحديث الوسط كل ثلاثة أيام. لحصاد العقد الجذرية الظهرية ، انقل الجنين الأول إلى طبق استزراع بحجم 10 سم يحتوي على PBS بدرجة حرارة الغرفة تحت مجهر تشريح في وضع الانبطاح وأدخل ملقطا صغيرا على طول جانبي الحبل الشوكي.
باستخدام التشريح الحاد ، افصل الحبل الشوكي عن الأنسجة الرخوة المحيطة باستخدام ملقط لاستئصال الحبل الشوكي على طول فتحة الرقبة وكعب الذيل. قم بإزالة الأنسجة الرخوة المتبقية من الحبل الشوكي المحرر حتى يبقى فقط الحبل الشوكي وجذور الأعصاب والعقدة الجذرية الظهرية المرفقة. افصل العقد الجذرية الظهرية الفردية عن جذورها العصبية المتصلة.
بعد ذلك ، استخدم قلم ماصة مزود بطرف ماصة سعة ملليلتر واحد لنقل ما يصل إلى 100 عقد جذرية ظهرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل من PBS. اجمع العقد عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية المؤتلف لكل أنبوب. بعد 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بالطرد المركزي للعقد الجذرية الظهرية مرة أخرى باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لترتريتوري الكريات برفق في وسط صيانة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية.
قم بزرع خلايا العقدة الجذرية الظهرية في خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع على 6 ألواح بئر مطلية ب poly-D-lysine laminin في 1.5 مل من وسط صيانة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية لكل بئر. بعد يومين في المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، اغسل الخلايا وأعد مزارع الخلايا العصبية إلى الحاضنة في وسط تنقية الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية الطازجة لمدة يومين آخرين. بعد ثلاث إلى أربع دورات صيانة وتنقية ، يجب أن تكون مزارع الخلايا العقدية الجذرية الظهرية إيجابية للعلامة العصبية Tuj-1 وسلبية لعلامة الخلايا الدبقية S100 beta.
في اليوم السابع من ثقافة الخلايا الشبيهة بخلية شوان ، اشطف الخلايا في PBS متبوعا بالتفكك باستخدام 0.5 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية المؤتلف لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الزراعة المشتركة وزرع الخلايا الشبيهة بخلايا شوان على ثقافة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية المنقاة في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع لمدة 14 يوما من الزراعة المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تظهر الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية الصحية مورفولوجيا مدببة على عكس المظهر الرباعي الزوايا للخلايا الجذعية الجذعية التي تم الحفاظ عليها لعدد كبير من الممرات وفقدت قدرتها المتعددة.
يجب أن تظهر مستعمرات MSC الموسعة التعبير عن علامات MSC ، وغياب علامات الخلايا الجذعية المكونة للدم ، والقدرة على التمايز إلى سلالات شحمية ، وعظم العظام ، وغضروفية. تظهر ثقافة MSC الصحية التي تعرضت للتكييف المسبق لنقص الأكسجين ، مجالات عصبية أكبر من حيث العدد والحجم. يمكن تأكيد نقاء شبكة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية من خلال التعبير عن العلامة العصبية Tuj-1 والغياب المصاحب لعلامة خلية Schwann S100.
بعد 14 يوما في الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية ، تكتسب الخلايا الشبيهة بخلايا شوان الميزات والخصائص الوظيفية لخلايا شوان الناضجة المرتبطة بالقدر. بمجرد إتقانها ، يمكن توسيع المجموعة السكانية الفرعية للسلف العصبي في BMSCs البشرية أو الفئران في غضون 10 أيام إذا تم تنفيذ تقنية توسيع الخلية بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من أن عينة BMSC تتمتع بأسلاف عصبية إيجابية للنستين وأن أسلاف المكونة للدم الإيجابية CD45 قد تمت إزالتها.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على BMSCs ، لإثراء السكان الفرعيين للسلف العصبي ، وتوجيه تمايز السلف العصبي إلى خلايا شوان الملتزمة بالمصير لاستخدامها في تعزيز إعادة نمو المحوريات بعد الصدمة وإعادة تكوين الميالين. بعد هذا الإجراء ، يمكن اشتقاق الخلايا الدبقية النخاعية ، مثل خلايا شوان الناضجة ، لاستخدامها في تطوير علاجات لإصابات وأمراض الجهاز العصبي المحيطي والمركزي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يعزز هذا البروتوكول الخلايا النخاعية النخاعية (MSCs) بالإمكانات العصبية من خلال التكييف تحت ظروف نقص الأكسجين، مما يوجه تمايزها إلى خلايا شوان ناضجة. تعالج هذه الطريقة التحديات في الطب التجديدي عن طريق استخدام مصدر محدود من الخلايا السليفة العصبية لتوليد الخلايا الدبقية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
الخلفية
- يحتوي النخاع العظمي على خلايا نخاعية ذات إمكانات عصبية.
- خلايا شوان ضرورية لإعادة نمو المحاور العصبية وإعادة الميالنة.
- هناك حاجة إلى تقنيات ثقافة فعالة لتوسع الخلايا العصبية.
- تركز هذه الدراسة على تعزيز غلة الخلايا السليفة العصبية من الخلايا النخاعية النخاعية.
هدف الدراسة
- إثراء الخلايا السليفة العصبية في النخاع العظمي.
- تسهيل التمايز إلى خلايا شوان وظيفية.
- تحسين العلاج الخلوي الذاتي لإصابات الأعصاب.
الطرق المستخدمة
- تكييف نقص الأكسجين للخلايا النخاعية النخاعية.
- تقنيات زراعة الخلايا لتعزيز التمايز العصبي.
- بروتوكولات استبدال الوسط وغسله.
- مراقبة تكوين المستعمرات على مدار أسبوع.
النتائج الرئيسية
- نجاح إثراء الخلايا السليفة العصبية من الخلايا النخاعية النخاعية.
- مستعمرات مرئية من خلايا شوان بحلول اليوم السادس إلى السابع.
- إمكانية تطبيق محتملة للعلاجات الخلوية الذاتية.
- معالجة القضايا الرئيسية في إصلاح الأعصاب بعد الصدمة.
الاستنتاجات
- يعزز البروتوكول بشكل فعال من غلة خلايا شوان.
- يوفر طريقة قابلة للتطبيق لاستخدام الخلايا النخاعية النخاعية في العلاجات التجديدية.
- قد تؤدي التطبيقات المستقبلية إلى تحسين النتائج في علاجات إصابات الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables the generation of mature Schwann cells from marrow stromal cells, addressing the limited availability of neural progenitors for autologous cell therapy in peripheral nerve injury. By enriching neuroprogenitors through hypoxic preconditioning, the approach supports predictive confidence in glial cell production for remyelination strategies. It provides a scalable, reproducible system for preclinical modeling of demyelinating diseases and spinal cord injury repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural progenitor commitment pathways from mesenchymal sources.
- Operational Value: Provides a defined, reproducible system to validate glial differentiation potential.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating hypoxia as a preconditioning variable for neurogenic enrichment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates Schwann cell-like cells with quantifiable S100β/p75 expression for phenotypic screening.
- Operational Value: Establishes a standardized co-culture assay with dorsal root ganglion neurons to assess myelination competence.
- Operational Value: Enables scalable neurosphere production for high-throughput progenitor expansion assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Produces fate-committed Schwann cells that form myelin segments, validating translational relevance.
- Operational Value: Supports preclinical continuity from progenitor expansion to functional myelination assays.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions for autologous cell therapies in demyelinating indications.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling progenitor enrichment, differentiation, and functional validation for glial cell therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on hypoxic preconditioning as a modulator of neural progenitor yield from MSCs.
- Screening: Delivers assay-ready Schwann cell-like cells with standardized glial marker expression for compound or condition screening.
- Analytics: Provides quantitative readouts via S100β/p75 co-expression and myelin segment formation to compare differentiation efficiency.
- Translational Research: Connects progenitor expansion to preclinical validation through neuron co-culture and myelination assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating clinical-grade Schwann cells from autologous MSC sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in glial cell generation by reducing variability in neural progenitor enrichment.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized hypoxic preconditioning and neurosphere formation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of myelination capacity in vitro.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of Schwann cell-based therapies for peripheral and central nervous system indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, hypoxic chamber operation, and neural differentiation techniques.
- Depends on specialized instrumentation including hypoxia chambers, low-attachment plates, and glial induction media components.
- Necessitates standardization across teams for consistent neurosphere size, co-culture timing, and marker assessment.
- Involves adaptation considerations when translating from rodent to human MSC sources and scaling for clinical use.
- Limited by the dependency on dorsal root ganglion neurons for final maturation, which may constrain throughput in industrial settings.
