تطوير هبسك المصل المشتقة الهيئات إمبريويد الحرة لاستجواب الثقافات الخلايا الجذعية 3-D باستخدام الفحوصات ذات الصلة فسيولوجيا

الهدف العام من هذا البروتوكول للأجسام الجنينية الحرة المصل iPSC البشري 3D, هو توفير نظام في المختبر الذي يقترب من التطور القشري البشري المبكر, والتي يمكن استخدامها لاكتشاف المخدرات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية مثل, كيف تستمد الخلايا العصبية من iPSCs, تشكل شبكات وظيفية في الأنسجة ثلاثية الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بنمذجة جوانب التطور القشري في طبق ، من الأنسجة البشرية التي تحتوي على علم الوراثة للأفراد المرضى، وبالتالي يعمل النظام كمنصة قائمة على الخلايا لفحص الأدوية القابلة للتطوير ويمكن استخدامها لدراسة العديد من الاضطرابات العصبية الحيوية المختلفة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاضطرابات النمو العصبي أو العصبي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل تلك التي تركز على نماذج وظيفة المناعة العصبية أو المعلومات العصبية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، ابدأ بإنشاء خلايا الجنين. لإنشاء هذه الثقافة ، قم بوضع 600 ، 000 خلية جنينية في كل بئر من ستة ألواح آبار ، مع 300 مل من الوسط لكل بئر.

بعد زراعة الخلايا الجنينية لمدة 48 ساعة ، استبدل الوسط. احتضان الألواح لمدة ساعة أثناء تحضير الخلايا الجذعية. قم بإذابة الخلايا الجذعية في حمام مائي 37 درجة مئوية.

بمجرد إذابتها ، انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر واملأ الأنبوب إلى خمسة ملليلتر بوسط الثقافة ، مع إضافة قطرة حكيمة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا برفق لمدة أربع دقائق ، وشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات برفق في مليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية باستخدام مثبط ROCK. بعد تحديد كثافة الخلية ، ضع 300 ، 000 خلية جذعية على الخلايا المغذية.

ثم قم بتنمية الثقافات وتوسيعها ، واختيار الخلايا السليمة بشكل دوري ، بعد توسيع الخلايا وتجميدها للنسخ الاحتياطي. قم بزراعة مستعمرات الخلايا الجذعية على الألواح القياسية حتى تصل إلى التقاء 50٪ إلى 70٪. بعد ذلك، استخدم علاجا إنزيميا خفيفا وخلية لطيفة بطرف ماصة سعة مليلتر واحد لحصاد hiPSCs لتمايز الخلايا السليفة العصبية.

الطرد المركزي بلطف التعليق, شفط طافي وإعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر الإنسان iPSC المتوسط. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى طبق ثقافة خلية مطلي بجيلاتين بنسبة 0.1٪ بخمسة سنتيمترات ، واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة ، انقل الخلايا غير الملتصقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا.

ثم اشطف اللوحة برفق بثلاثة ملليلتر من الوسط وانقله إلى نفس الأنبوب. بعد ذلك ، كرر خطوة إعادة التعليق باستخدام الطرد المركزي اللطيف ، ثم حدد كثافة الخلية وقم بتقطيع الخلايا إلى 96 بئر ، صفيحة سفلية منخفضة الالتصاق V عند 9 ، 000 خلية لكل بئر. الآن ، قم بتدوير اللوحة لمدة ثلاث دقائق وابدأ في زراعة الخلايا.

على مدار ال 14 يوما التالية ، استبدل نصف وسيط كل يومين بمتوسط متوسط مميز جديد. بعد أسبوعين من زراعة الخلايا ، قم بإعداد ست ألواح بئر مع إدخالات مزرعة خلايا 40 ميكرون ومليلتر واحد من وسط DM1. احتضان هذه الألواح لمدة أربع ساعات على الأقل قبل إضافة الخلايا المستنبتة.

بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة فم عريض سعة 200 ميكرولتر ، اجمع مجاميع الخلايا التي يبلغ عمرها أسبوعين بقيمة حوالي 20 ميكرولترا من المتوسط. انقل أربعة إلى ستة مجاميع على كل ملحق بأقل قدر من المحلول ، وقم بإزالة أي فائض. خلال هذه الخطوة ، من المهم العمل بسرعة وبيد ثابتة ، أثناء إزالة الوسيط من حول SFEBs ، قد ترى SFEBs تتحرك عبر المحلول بسبب التوتر السطحي.

لا بأس في إعادة موضعها بعد إزالة الوسيط. بمجرد تحميل جميع الركام على الإدخالات ، قم بتغيير الوسط إلى مليلتر واحد من DM2 واستمر في زراعة الخلايا كل يومين. استبدل ثلاثة أرباع الوسط بوسط جديد.

بعد 14 يوما من الثقافة ، ابدأ في إضافة وسيط DM3 إلى الثقافات. استمر في الزراعة لمدة 16 يوما أخرى لتنمية SFEBs. الآن افصل SFEBs برفق عن الملحق باستخدام طرف ماصة فم بعرض 200 ميكرولتر.

انقل SFEBs إلى 12 لوحة بئر ، وقم بتحميل أربعة إلى ثمانية لكل بئر. ثم قم بتلطيخها كمخطط تفصيلي في بروتوكول النص. لتحضير البئر 12 والأطباق الثمانية ، اغسلها أولا ثلاث مرات بالماء المعقم.

ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام 75٪ إيثانول ومرة أخرى باستخدام 100٪ إيثانول. ثم اخبزي الأطباق على حرارة 50 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات رأسا على عقب لإكمال عملية التعقيم. بعد الخبز ، أضف 500 ميكرولتر من محلول 0.2٪ PEI إلى كل بئر واترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

بعد ذلك ، قم بشفط جزيرة الأمير إدوارد واغسل الآبار أربع مرات بالماء المقطر المعقم وجففها بالهواء طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإعداد غلاف طازج في L15 متوسط وأضف 10 ميكرولتر إلى وسط كل بئر. ثم أضف الماء المقطر إلى الخزانات المحيطة لمنع التبخر واحتضان الصفيحة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

تأكد من إرسال مادة التغليف في وسط الأقطاب الكهربائية ، مع الحرص على عدم تجاوز مساحة أقطاب التأريض ، إذا تجاوزت هذه المساحة ، ستنمو الخلايا العصبية فوق أقطاب التأريض ، مما يتسبب في حدوث قطع أثرية للضوضاء ويؤثر على دقة التسجيل. الآن ، أضف SFEB محضرا واحدا في كل بئر ، باستخدام شفط لطيف مع ماصة واسعة التجويف. ثم أضف 200 ميكرولتر من DM2 إلى كل بئر وقم بزراعة الطبق طوال الليل.

في وقت لاحق ، لتسجيل النشاط العصبي ، ضع لوحة في قارئ اللوحة. سخنه إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم البرنامج لتسجيل 10 دقائق من النشاط من كل بئر.

يزرع SFEB باستخدام الطريقة الموصوفة ، حيث ينتج عن أنسجة ذات خصائص مورفولوجية تشبه المنطقة القشرية تحت البطينية القشرية المبكرة التطور المليئة بالخلايا العصبية الإيجابية Tuj1 الواسعة ، بالإضافة إلى الأسلاف العصبية. لوحظ العديد من الوريدات القشرية النامية في الطبقات الخارجية وفي الطبقات الداخلية للأجسام. تشبه الحافة الخارجية للأجسام صفيحة قشرية نامية تحتوي على خلايا عصبية بعد الانقسام ، وهذا مدعوم بالتعبير عن Brn2 ، وهي علامة للأسلاف العصبية والطبقات القشرية الخارجية الأكثر تبطينية.

الطبقات الخارجية أيضا على خلايا موجبة Reelin قد تكون خلايا غراتزل عرضية أو أسلافها. كما عبرت الجثث عن علامات تتفق مع أصل العقدة العقدية المختلطة والعقدية الإنسية. بناء على التعبير عن علامات TF2 و Nkx2.1 المطبوخة.

تنتج SFEBs المستزرعة في كل من الخلايا العصبية البينية الإيجابية CalR و CalB. بالإضافة إلى الخلايا العصبية المثيرة الإيجابية VGLUT والأسلاف العصبية الجلوتاماتية الإيجابية Tbr1. تمشيا مع التقارير الأخرى ، كانت 61٪ من الخلايا من الأجسام إيجابية VGLUT و 43٪ كانت إيجابية Tbr1.

يمكن التقاط تسجيلات MEM المصنوعة من الأجسام لفترات طويلة من الزمن وأظهرت التسجيلات تطور انفجار مستوى الشبكة القشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة SFEBs من iPSCs البشرية, توصيف محتوى الخلايا العصبية من الوريدات القشرية النامية العقابية مع NSFEBs. وإجراء فحوصات فيزيولوجية عصبية على نضوج SFEBs.

عموما, الأفراد الجدد على هذه الطريقة قد تكافح لأنه يستغرق وقتا وممارسة لتطوير المجال العلمي اللازم لسلوك iPSCs و iPSC للوصول إلى الخلايا العصبية في الثقافة. يجب مراقبة الخلايا المستنبتة يوميا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الكالسيوم من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما يمكن أن تفعله العلاجات الدوائية لتذبذبات الشبكة القشرية.