التنبؤ الجينات إسكات من خلال التحكم المكاني الزماني من سيرنا الافراج عن نانوكاريرز البوليمرية استجابة الصورة

الهدف العام لهذه الطرق هو عدم القدرة على التنبؤ بكفاءات إسكات الجينات الصغيرة بوساطة الحمض النووي الريبي المتداخلة وتسهيل التحكم في مستويات التعبير عن البروتين الناتجة ، بطريقة زمنية مكانية. يمكن لهذه الطريقة توضيح علاقات الهيكل والوظيفة ومركبات التوصيل المستجيبة للمحفزات. يمكن أن يؤدي اكتساب تحكم أفضل في الربط مقابل الإطلاق إلى فتح المنصات القابلة للترجمة واكتشاف الأدوية ، بالإضافة إلى تقنيات الطب التجديدي.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في التغيرات في التعبير الجيني التي يمكن التحكم فيها والتنبؤ بها على القاعدة كمقايسات بسيطة لإطلاق siRNA ونمذجة حركية. على الرغم من أن هذه الطرق تستخدم بوليمرات جديدة مستجيبة للصور ، إلا أن هذه المجموعة من المقايسات يمكن تكييفها بسهولة لاختبار مجموعة متنوعة من الأنظمة الأخرى المستجيبة للمنبهات. للبدء ، قم بإعداد محلول siRNA 32 ميكروغرام لكل مليلتر ، عن طريق إضافة siRNA إلى محلول HEPES 20 ميكرومولار عند درجة الحموضة السادسة.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول بوليمر عن طريق إضافة بوليمرات polyAPN BMA ذات كتلة mPEG الذائبة إلى محلول HEPES 20 مليمولار عند درجة الحموضة السادسة. لتحقيق تركيز 220 ميكروغرام لكل مليلتر ، سينتج عن هذا التركيز نسبة N إلى P تبلغ أربعة ، مما يعني أنه سيكون هناك أربعة أضعاف عدد مجموعات الأمين على البوليمر مثل مجموعات الفوسفات على siRNA. بعد ذلك ، أضف محلول البوليمر إلى حجم متساو من محلول siRNA ، مع الخلط برفق على آلة دوامة.

استمر في الدوامة لمدة 30 ثانية بعد إضافة البوليمر. ثم احتضان العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف محلول STS إلى كل محلول ناقل نانوي أثناء الخلط برفق على آلة دوامة.

استمر في الدوامة لمدة 30 ثانية بعد إصدار SDS. الطرد المركزي للعينات عند 3 ، 000 Gs لمدة خمس ثوان ، ثم احتضان العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. معايرة وضبط ليزر الأشعة فوق البنفسجية بفلتر 365 نانومتر بكثافة 200 واط لكل متر مربع.

بعد ذلك ، قم بقطع ثقب في حشية مطاطية ، ضع الحشية المطاطية على شريحة زجاجية مغسولة ومجففة. ماصة محلول SDS الناقل النانوي على الشريحة الزجاجية داخل فتحة الحشية المطاطية. قم بتحميل فائض من المحلول على الشريحة الزجاجية ، مع تجنب ملامسة الحشية المطاطية.

ضع الشريحة الزجاجية الثانية أعلى حشية الشريحة. لتجنب توليد فقاعة الهواء ، ضع أحد طرفي الشريحة لأسفل أولا ثم قم بخفض الطرف الآخر ببطء. قم بتوصيل مشابك الموثق بكل جانب من جوانب الحجرة الزجاجية لإبقائها قريبة.

قم بتشعيع العينات للمدة الزمنية المطلوبة ، باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع مرشح 365 نانومتر بكثافة 200 واط لكل متر مربع. قم بإزالة مشابك الموثق وافتح الغرفة. بعد ذلك، قم بوضع ماصة 25 ميكرولترا من عينات SDS الحاملة النانوية المشعة على أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.

احتضان المحاليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف خمسة ميكرولترات من محلول التحميل المؤقت إلى 25 ميكرولترا من كل عينة SDS للحاملين النانويين. احتضان العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بتحميل 30 ميكرولترا من كل عينة SDS من الحاملات النانوية في هلام الاغاروز بنسبة 2٪ ، ملطخ مسبقا ببروميد الإيثيديوم. قم بتشغيل الجل في الظلام عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. قم بتصوير الجل باستخدام نظام تصوير هلامي مع مرشحات بروميد الإيثيديوم.

احفظ ملفات صور الهلام وتابع القياس الكمي لشدة الانحناء كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإزالة قطع الورق من فاصل لاصق على الوجهين لكشف السطح اللاصق. قم بتوصيل الفاصل بزلة غطاء زجاجي.

ماصة محلول SDS الحامل النانوي على زلة الغطاء. بعد ذلك ، ضع شريحة زجاجية مغسولة مسبقا أعلى زلة الغطاء مع وجود فتحة من الفاصل اللاصق ، تتمحور حول العينة. اضغط على الشريحة الزجاجية للتأكد من أن الشريحة الزجاجية وانزلاق الغطاء متصلان جيدا وتشكيل ختم.

استخدم مجهريا متحد البؤر مع هدف غامر بالماء 40 مرة ، مع فتحة عددية تبلغ 1.2 لقياسات FCS. استخدم قناة ليزر الإثارة المناسبة لجمع ما لا يقل عن 30 قياسا مدة كل منها 10 ثوان لكل عينة. بعد ذلك ، أدخل بيانات إصدار siRNA من FCS في نموذج حركي للتنبؤ باستجابات إسكات الجينات ، كما هو مفصل في بروتوكول النص.

لتحضير توصيل siRNA في المختبر ، أضف أولا ملليلترين من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة الآبار الستة. دع الخلايا تلتصق وتتعافى لمدة 24 ساعة في الحاضنة. بعد غسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، قم بإعدادها للنقل عن طريق إضافة 1.5 مل من المصل ووسط النقل الخالي من المضادات الحيوية.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من محلول الناقل النانوي ، الذي يحتوي على 30 بيكومول من siRNA tp لكل بئر. قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. ضع الخلايا في الحاضنة لمدة ثلاث ساعات.

قم بإزالة وسيط الحمل واغسل كل منهما جيدا باستخدام PBS. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط النمو المكمل وضع الخلايا في الحاضنة للتعافي لمدة 30 دقيقة. لتحضير الخلايا للعلاج بمحفز ضوئي ، قم بإزالة وسط النمو المكمل.

ثم أضف ملليلتر واحد من وسط الحمل إلى كل بئر. بعد معايرة ليزر الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في بروتوكول النص ، ضع الخلايا على لوح تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. قم بإزالة الغطاء من لوحة الآبار الستة.

قم بإشعاع الخلايا من فوق اللوحة للوقت المطلوب ، باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية بمرشح 365 نانومتر بكثافة 200 واط لكل متر مربع. قم بإزالة وسط الحمل وأضف ملليلترين من وسط النمو المكمل. ضع الخلايا في الحاضنة حتى مزيد من التحليل.

لإعداد قناع صور يحجب الضوء 365 نانومتر تماما ويقلل من الانعكاسات ، قم أولا بقص و / أو ثقب و / أو آلة الشكل المطلوب في قناع الصورة. قم بلصق قناع الصورة في الجزء السفلي من لوحة الآبار الستة ، مع توسيط النمط على البئر الذي يحتوي على الخلايا والجانب المضاد للانعكاس المواجه للوحة. قم بإعداد اثنين من الحلقات على بعد حوالي 25 مترا وفصل منصة لكل حامل حلقي ، بحيث تكون المنصات متساوية الارتفاع.

قم بتعليق لوحة الخلية بين المدرجين عن طريق وضع اللوحة فوق المنصات. قم بتشعيع الخلايا من أسفل العينة للوقت المطلوب ، باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية بمرشح 365 نانومتر ، بكثافة 200 واط لكل متر مربع. قم بإزالة وسط الحمل وأضف ملليلترين من وسط النمو المكمل.

ثم ضع الخلايا في الحاضنة للتعافي لمدة 24 ساعة على الأقل. قم بتصوير الخلايا باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح سابقا. يظهر هنا ، مثال على النمذجة الحركية البسيطة لديناميكيات إسكات الجينات.

تم تشغيل النموذج للتنبؤ بتركيزات mRNA والبروتين و siRNA ، كدالة للوقت التالي لإطلاق siRNA المستحث بالضوء. تم إدخال الكميات النسبية من siRNA التي تم إطلاقها بعد جرعات مختلفة من الضوء ، كتركيز siRNA الأولي في النموذج الحركي. كانت تنبؤات النموذج الناتجة لمستويات التعبير عن البروتين اتفاقا مع مستويات التعبير المحددة تجريبيا التي تم الحصول عليها من خلال النشاف الغربي.

للتصور ، تمت معالجة الخلايا التي تعبر عن GFP باستخدام GFP الذي يستهدف siRNA وتم وضع قناع صور شرجي على اللوحة قبل التشعيع لتوليد نمط دائري. أظهرت الخلايا المحمية من الضوء شدة مضان لا يمكن تمييزها عن عينات التحكم التي لم تتم معالجتها بالحمض النووي الريبي والضوء. ومع ذلك ، لم تظهر جميع الخلايا تقريبا داخل النمط الدائري أي تعبير عن GFP ، مما يشير إلى إطلاق siRNA الفعال والضربة القاضية للجينات.

علاوة على ذلك ، فإن استخدام الضوء هو تعبير جيني ممكن للتشغيل ، يمكن التحكم فيه على مقاييس الطول الخلوي. باختصار ، تتيح هذه الطريقة التحديد السريع لظروف التشعيع للتحكم المكاني والزماني في إطلاق siRNA والتنبؤ بإسكات الجينات بداهة. سيساعد استخدام هذا البروتوكول في توضيح علاقات الهيكل والوظيفة التي تحكم استقرار وفعالية الموجة الحاملة النانوية.

قد تمكن هذه التقنية من التطبيقات في الطب التجديدي التي تتطلب تحكما مكانيا وزمانيا في التعبير الجيني. هذه التركيبات مناسبة تماما لعلاج الاضطرابات الموضعية مثل سرطان الجلد ، وكذلك الاضطرابات الجلدية.