طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي

الهدف العام من هذه التجربة هو استخراج التعايش الداخلي من الحشرات الصغيرة لمزيد من التجارب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الحشرات وعرض علم الأحياء الكلي لأن معظم التعايش الداخلي لا يمكن استزراعه في المختبر. طريقة تظهر عزل كميات كافية من البكتيريا لمزيد من التجارب مهمة جدا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا عزل التعايش الداخلي البكتيري للذبابة البيضاء بسهولة. يمكن تطبيق ذلك أيضا على عزل التعايش الداخلي عن الحشرات الأخرى مثل حشرات المن ، ونطاطيس النباتات ، والتربس. للبدء ، اجمع ذبابة بيضاء بالغة فردية وقم بتجانسها في 30 ميكرولترا من محلول التحلل.

احتضان التجانس عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. باستخدام الحمض النووي للذبابة البيضاء ، وبادئات أوكسيديز السيتوكروم 1 للميتوكونديال ، قم بإعداد تفاعلات PCR 25 ميكرولتر باستخدام الكواشف التالية.

ثم قم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البرنامج الموضح هنا. بعد ذلك ، استخدم مجموعة استخراج هلام الحمض النووي باتباع البروتوكول الموصى به لتنظيف منتج PCR. ثم قم بإجراء تحليل التسلسل وفقا لبروتوكول النص.

لتضخيم جينات معينة لكل تعايش داخلي داخل الذبابة البيضاء ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي للذبابة البيضاء. وفقا لبروتوكول منشور سابقا ، قم بإخضاع العينة المضخمة للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز والتسلسل لتحديد الأنواع البكتيرية داخل الذبابة البيضاء وتحديد الجين المحدد لكل بكتيريا. لتشريح وتنقية بكتيريا الذبابة البيضاء ، أضف 100 ميكرولتر من محلول 1x PBS على شريحة مجهرية.

ثم اختر حوريات الطور الثالث أو الرابع من أوراق القطن. واغمرهم في PBS. تحت المجهر ، استخدم إبر حشرية دقيقة لسحب البكتيريا من جسم الذبابة البيضاء.

توخي الحذر عند عزل البكتيريا لأنها صغيرة وهشة. اقطع حفرة برفق على جانب واحد من الحورية واضغط قليلا على الجانب الآخر لإخراج الجراثيم. بعد ذلك، قم بتركيب محمل صغير سعة 20 ميكرولتر على ماصة سعة 0.5 إلى 10 ميكرولتر، واستخرج البكتيريا الفردية من PBS إلى اللودر الصغير.

اغسل البكتيريا للقضاء على تلوث أنسجة الذبابة البيضاء الأخرى عن طريق إدخال البكتيريا في PBS واستخراجها. كرر الغسيل ثلاث مرات. يوصى بشدة بتكرار الغسيل للتخلص من أكبر قدر ممكن من التلوث.

قم على الفور بتقطيع البكتيريا المغسولة في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 60 ميكرولترا من PBS. تقوم المحقنة بتصفية البكتيريا المجمعة من خلال غشاء مرشح بطول خمسة ميكرومترات. كرر الترشيح عدة مرات لتحريك السائل المختلط جيدا عبر الغشاء.

لتضخيم المرشح ، قم بإعداد المخزن المؤقت D2 لاستخدامه مع البروتوكول الموصى به لتضخيم الحمض النووي الجيني من الدم أو الخلايا مع بعض التعديلات. أضف مباشرة 1.5 ميكرولتر من المرشح إلى أنبوب الطرد المركزي متبوعا ب 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت D2. تخلط جيدا وتحتضن العينة على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم أضف 1.5 ميكرولتر من محلول التوقف.

أضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتفاعل وميكرولتر واحد من بوليميراز الحمض النووي واخلطه برفق. يحتضن الخليط على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة متبوعا ب 65 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة على المرشح المضخم باستخدام بادئات محددة مصممة للبكتيريا لتأكيد أنواع البكتيريا.

قم أيضا بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد ما إذا كان هناك تلوث من جينوم المضيف باستخدام بادئات لجينات الذبابة البيضاء بيتا أكتين و EF1 وفقا للطريقة المنشورة سابقا. أخيرا ، قم بإجراء تسلسل الجينوم الفوقي وفقا لبروتوكول النص. في هذا الشكل ، يظهر قطن لتربية الذباب الأبيض والعديد من مراحل نمو الذباب الأبيض.

بما في ذلك الحوريات البالغة والأولى والثانية والرابعة. يظهر هنا تحليل FISH للتعايش الداخلي Portiera و Hamiltonella داخل حورية الطور الرابع ل MEAM1. لوحظ تداخل البكتيريا وكلاهما يقتصر على بكتيريا الذبابة البيضاء.

تظهر هنا صور المجهر الإلكتروني للإرسال للتعايش الداخلي Portiera للذبابة البيضاء مما يشير إلى أن Portiera قد يفقد جدار الخلية. بعد تسلسل وتنظيف بيانات التلوث للمحولات والازدواجية ، تم الحصول على الجينوم الكامل للتعايش الإلزامي Portiera. مما ينتج عنه جينوم دائري من 358 ، 232 زوجا أساسيا.

بالإضافة إلى ذلك ، تم الحصول على مسودة جينوم Hamiltonella التي تضمنت 138 contigs تم تجميعها في 89 سقالة بناء على العلاقات النهائية المزدوجة. بمجرد إتقان هذه التقنية يمكن القيام بها في غضون 20 ساعة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على العينات من تلوث البكتيريا البيئية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل آخر مثل تسلسل التهاب المفاصل الروماتويدي والبكتيريا الجماعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير الجيني للتعايش الداخلي والتمثيل الغذائي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الحشرات وعلم الأحياء الدقيقة لاستكشاف وظيفة التعايش الداخلي في الحشرات أو المفصليات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج المتعايشين من بكتيريا الحشرات.

لا تنس أن العمل مع بعض الكواشف يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.