بروتوكول المسح الضوئي على مدار الساعة لتحليل الصور: إيماجيج الإضافات

الهدف العام من بروتوكولات مسح الساعة هذه هو السماح بالتوصيف السريع لمتوسط كثافة البكسل داخل مناطق اهتمام مختارة، أو على طول حدودها، و/أو خارجها. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية وتعليم محللي الصور حول متوسط كثافة البكسل ضمن مناطق اهتمام محددة. وتتمثل المزايا الرئيسية لتقنية مسح الساعة هنا في إمكانية استخدامها لتوصيف متوسط كثافة البكسل بسرعة من المدار في منطقة اهتمام واحدة أو مناطق متعددة.

لإجراء تحليل مسح الساعة القياسي، من قائمة File، وفي برنامج ImageJ المناسب، اختر Open لفتح ملف الصورة المطلوب. على سبيل المثال، سيتم هنا تحليل مقطع نسيجي يحتوي على عصبونات تم وسمها لبروتين معين. اختر أداة رسم مناسبة، وقم بتحديد منطقة الاهتمام.

اختر Plugins ثم Clock Scan من قائمة File لفتح نافذة خيارات بروتوكول مسح الساعة القياسي. ستفتح أيضاً نافذة مدير منطقة الاهتمام (region of interest manager) مع إضافة المخطط التفصيلي تلقائياً. في نافذة خيارات Plugin، استخدم أشرطة التمرير لتغيير إحداثيات x و y في مركز منطقة الاهتمام، حسبما يلزم.

بناءً على مقدار منطقة الخلفية خارج الجسم التي يجب أن يشملها المسح، استخدم شريط تمرير حدود المسح (scan limit) لضبط هذه الحدود. حدد مربعات الاختيار الخاصة بنصف القطر الحقيقي (real radius)، وطرح الخلفية (subtract background)، والتحويل القطبي (polar transform)، و/أو الرسم البياني مع الانحراف المعياري (plot with standard deviation) حسبما يقتضيه التجريب. ثم انقر فوق موافق (OK) لتشغيل الملحق البرمجي.

بمجرد اكتمال التحليل، استخدم الأمر list للوصول إلى البيانات الرقمية لإجراء مزيد من التحليلات. وبالنسبة لتحليل مسح الساعة (clock scan analysis) لعدة مناطق، افتح ملف صورة يحتوي على مناطق اهتمام متعددة. على سبيل المثال، سيتم هنا تحليل لوحة من الإطارات التي تم التقاطها ضمن المقطع النسيجي نفسه، كما تم توضيحه للتو.

انقر على Analyze، ثم Tools، ثم Region of Interest Manager واستخدم أداة الرسم المناسبة لتحديد كل منطقة اهتمام. وتعد أداة الخط المجزأ مفيدة لاختيار مناطق الاهتمام غير المتماثلة، ولإقصاء وسم الخلفية. انقر على Add في نافذة Region of Interest Manager لإضافة كل منطقة اهتمام إلى المدير فور اختيارها.

من قائمة الملحقات (Plugins)، اختر "Multi Clock Scan" لفتح نافذة خيارات البروتوكول المنبثقة وقم بإعادة ضبط حد المسح، حسب الضرورة. قم بتفعيل خيارات "plot with standard deviation" (الرسم البياني مع الانحراف المعياري) و/أو "subtract background" (طرح الخلفية)، وفقاً لما يتناسب مع التجربة. بعد ذلك، انقر على "OK" لتشغيل البروتوكول، والذي سيقوم بإنشاء نافذتين للرسم البياني الناتج.

لإجراء تحليل مسح الساعة (clock scan) لمجموعة من الصور، افتح مجموعة الصور المطلوبة. في هذه الحالة، سيتم تحليل مجموعة صور لعقدة جذرية ظهرية معزولة، تم وسمها بفلوريسنت حساس للكالسيوم وتصويرها قبل وبعد التحفيز بالقطب الكهربائي داخل الخلايا. قم بتحديد منطقة الاهتمام ضمن مجموعة الصور.

أضف مجموعة الصور المختارة إلى مدير منطقة الاهتمام (region of interest manager)، كما تم توضيحه للتو، واختر المسح متعدد الساعات (Multi Clock Scan) لفتح النافذة المنبثقة لخيارات البروتوكول. أعد ضبط حد المسح حسب الضرورة، وقم بتفعيل خياري التمثيل البياني مع الانحراف المعياري (plot with standard deviation) و/أو مربعات طرح الخلفية (subtract background boxes)، وفقاً لما هو مناسب تجريبياً. ثم انقر فوق موافق (OK) لتشغيل البروتوكول، مما سينتج نافذتين من الرسوم البيانية المخرجة.

في هذا التحليل التمثيلي لمقطع نسيجي يحتوي على عصبونات مُعلمة فلوروسنتياً، تم رسم منطقة اهتمام عبر الإشارة الساطعة للبروتين المستهدف، وأُجري تحليل مسح الساعة القياسي لجمع مسوحات شعاعية لكثافة البكسل من مركز منطقة الاهتمام إلى حد المسح المحدد. تم تطبيع المسوحات الشعاعية بالنسبة لنصف قطر منطقة الاهتمام في اتجاه المسح. ومن ثم أُجري متوسط حسابي لإنتاج ملف تعريف تكاملي لكثافة البكسل الشعاعية، وهو ما كشف أن معظم البروتين المستهدف تم قياسه عند الغشاء البلازمي للخلية.

بما أن خيار الرسم البياني مع الانحراف المعياري قد تم اختياره لهذا التحليل، فإن خطوط الانحراف المعياري الرأسية تشير إلى التباين في كثافة البكسلات بين ملفات المسح الشعاعي الفردية عند مسافة محددة من نقطة أصل المسح. في هذا التحليل، تم مسح مناطق متعددة ذات أهمية ضمن عينة نسيج العصبون، كما تم توضيحه للتو، مما أدى إلى إنشاء ملف تعريف تكاملي لكثافة البكسلات لكل جسم ممسوح في التسلسل الذي تمت فيه إضافتها إلى مدير المناطق ذات الأهمية، بالإضافة إلى ملف تعريف متوسط لكثافة البكسلات لكل منطقة مختارة ذات أهمية.

وبناءً على ذلك، تمثل أشرطة الانحراف المعياري هذه التباين بين عمليات المسح التكاملية للأجسام الفردية، بدلاً من عمليات المسح الشعاعي الفردية. هنا، تم إجراء تحليل لمجموعة صور لعصبون معزول من العقدة الجذرية الظهرية تم تصويره في أوقات مختلفة، قبل وبعد التحفيز، عبر قطب كهربائي داخل خلوي. وفي نهاية التحليل، تم عرض ملف تعريف شدة البكسل التكاملي للحالات الفردية للجسم المستهدف في الصور المختلفة ضمن المجموعة، بالإضافة إلى ملف تعريف متوسط شدة البكسل لجميع حالات هذا الجسم.

علاوة على ذلك، يُظهر تحليل الانحراف المعياري لمجموعة صور ممسوحة ضوئيًا بأسلوب المسح الساعي (clock scan) تباين البيانات بين عمليات المسح التكاملية عبر مجموعة الصور بأكملها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس شدة البكسل باستخدام إضافات المسح الساعي. كان هدفنا من تطوير هذه الإضافات هو جعل هذه الأنواع من تحليل الصور متاحة مجانًا لكل باحث.

نحن نؤمن بأن بروتوكول مسح الساعة سيُستخدم في العديد من مجالات البحث، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تطبيقات التصوير البيولوجي والكيميائي والفيزيائي. وبينما نواصل تطوير وتشغيل إضافات مسح الساعة هذه، فإننا سنقدر أي ملاحظات أو اقتراحات من الجهات المهتمة حول كيفية تحسين هذه الأدوات.