الضوء بوساطة تعديل عكسها من الميتوجين تنشيط كيناز مسار البروتين خلال تمايز الخلايا و القيطم التنمية الجنينية

الهدف العام من هذه التجربة هو استخدام الضوء للتحكم في مسار إشارات بروتين كيناز المنشط بالميتوجين في الخلايا السليمة وفي أجنة Xenopus. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الخلوي والتنموي ، مثل كيف تنظم التعديلات الزمنية لنشاط كيناز تقرير المصير أثناء تمايز الخلايا ، والتطور الجنيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التحكم في نشاط بروتين كيناز المنشط بالميتوجين بشكل عكسي في الخلايا السليمة والكائنات متعددة الخلايا ، مثل الأجنة النامية.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لحركية الإشارات أثناء التطورات الجنينية ل Xenopus. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة نموذجية أخرى مثل سقطرى أو الزرد أو الفأر. اليوم ، سيقوم طالب دراسات عليا من مختبري ، فيشنو كريشنامورثي ، بعرض الإجراء.

وسيوضح أورورا تورجون ، ما بعد النجم في مختبري ، جميع الإجراءات المتضمنة في أجنة Xenopus. أولا ، قم بتجميع جهاز زراعة الخلايا عن طريق وضع غرفة PDMS معقمة معقمة على زلة غطاء معقمة مطلية ب PLL في طبق بتري 60 مم. بعد ذلك ، استخدم 0.5 مل من 0.25٪ التربسين لفصل خلايا pHK21 من بئر واحد من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار.

بعد حساب كثافة الخلية باستخدام مقياس الدم ، قم بزرع الغرفة ب 20،000 خلية في 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا. بعد 24 ساعة من طلاء الخلية ، قم بنقل الخلايا ب 50 إلى 100 نانوجرام من CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG من بلازميد PCaA X وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ثلاث ساعات من التعدي ، قم بتغيير الوسط إلى 200 ميكرولتر من وسط الزراعة الطازجة واسمح للخلايا بالتعافي بين عشية وضحاها عن طريق احتضان المزرعة في حاضنة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، ابدأ التحريض البصري الوراثي والتصوير عن طريق استبدال وسط زراعة الخلية أولا ب 200 ميكرولتر من الوسط المستقل لثاني أكسيد الكربون. ثم قم بإعداد بروتوكول الحصول على البيانات. حدد 488 قناة FITC للإثارة غير الوراثية للتحفيز البصري الوراثي ، وقناة CRITC للإثارة 561 نانومتر لتتبع التوطين الخلوي للبروتين المسمى mChery.

قم بقياس قوة الضوء الأزرق عن طريق وضع عداد طاقة بالقرب من نافذة الهدف. الطاقة الإجمالية البالغة اثنين من الميكروواط كافية للحث على ارتباط CIBN CRY2-PHR. قم بإعداد اكتساب طابع زمني مع الفاصل الزمني الخمس ثوان.

وإجمالي وقت الاستحواذ دقيقتين. قم بتطبيق مواد مطابقة الفهرس المناسبة في نافذة الهدف. ضع حجرة الخلية على مرحلة المجهر واستخدم وضع المجال الساطع للتركيز على الخلايا الموجودة على سطح الغطاء باستخدام قطع العين.

بعد ذلك ، حرك مرحلة المجهر لتحديد موقع الخلية المنقولة تحت الضوء الأخضر. تسجيل سلسلة من الصور المختومة زمنيا في كل من قناتي FITC و CITC. تظهر صورة العينة الأساسية CIBNGPCAAX مترجمة على غشاء البلازما.

هذه لقطة ل CRY2 mCherry raf1 قبل محاكاة الضوء الأزرق ، بينما تظهر هذه الصور لقطة من CRY2 mCherry raf واحد بعد عشر نبضات من تحفيز الضوء الأزرق. اصنع مجموعة LED عن طريق إدخال مصابيح LED زرقاء لونية اللون في لوحين والاتصال بمقاومات الحد من التيار. ضع ألواح التجارب في صندوق من الألومنيوم.

أدخل سلكين معدنيين لتوصيل الألواح بمصدر الطاقة. تأكد من أن طول السلك كاف عند وضع صندوق الضوء داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون. ثم ضع موزع ضوء شفاف ليكون بمثابة غطاء لصندوق الضوء.

أخيرا ، قم بمعايرة خرج الطاقة لكل مصباح LED في مجموعة من مدخلات الجهد. استخدم قوة نقطة صفر مللي واط لكل سنتيمتر مربع لمقايسة تمايز الخلايا PC12 على مدار 24 ساعة. ضع مجموعة LED في حاضنة 37 درجة مئوية مكملة بخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

قم بتوصيله بمصدر الطاقة باستخدام الأسلاك المعدنية واضبط طاقة LED على نقطة صفر مللي واط لكل سنتيمتر مربع. ضع لوحة 12 بئر تحتوي على خلايا PC12 المنقولة على نافذة مصفوفة LED. قم بمحاذاة اللوحة بحيث تكون كل بئر مضاءة بالكامل.

ضع إضاءة ضوئية مستمرة لمدة 24 ساعة. لتصوير الخلايا المتمايزة ، قم بإعداد الحصول على بيانات لقطة واحدة. استخدم 200 مللي ثانية لكل من قناتي GFP و TexasRed.

التقط صورا للخلايا المنقولة في كل من قنوات GFP و TexasRed ، واحفظ الملفات لتحليل البيانات. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تصنيع إبر للحقن المجهري للحمض النووي الريبي عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب الشعيرات الدموية. قم بإزالة طبقة الهلام من الأجنة عن طريق معالجتها بثلاثة بالمائة من السيستين المخفف في 0.2 XMMR لمدة 15 دقيقة.

نقل الأجنة إلى ثلاثة بالمائة من محلول السكروز وصفر نقطة خمسة XMMR للحقن المجهري. قم بحقن 500 بيكوغرام بدقة في نانوجرام واحد من الحمض النووي الريبي CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX في كل جنين. ثم استزراع الأجنة المحقونة في محلول الحقن المجهري في درجة حرارة الغرفة.

عندما تصل الأجنة إلى مرحلة المعدة الطبية ، انقلها إلى محلول MMR 0.2x ، واستمر في الزراعة حتى المرحلة المطلوبة من التطور. ثم ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا على مجموعة LED المصممة في المنزل لمعالجة الضوء الأزرق. ضع مرآة فوق اللوحة المكونة من 12 بئرا لضمان إضاءة الضوء الأزرق الكامل للأجنة.

احصد الأجنة لتحليل نسيجي أو لطخة غربية أو بيان جيني بعد التعرض للضوء الأزرق للوقت المطلوب. تظهر هذه الصورة لقطات متعددة القنوات لخلايا PC12 تم نقلها باستخدام CRY2-2A-2CIBN بعد 24 ساعة من تحفيز الضوء الأزرق عند نقطة صفر مللي واط لكل سنتيمتر مربع. ينظر إلى كل من مراسلي GFP و mChery.

الدوائر إلى الخلايا المتمايزة والمربعات تشير إلى الخلايا غير المتمايزة. هنا تم التعامل مع الخلايا بنفس الطريقة التي تم بها التعامل مع تلك الموجودة في الصورة السابقة ، باستثناء عدم استخدام تحفيز الضوء الأزرق. لا يوجد تمايز.

تظهر هذه الخلايا نتائج تمثيلية بعد التعدي باستخدام raf1 GFPCaaX ، وهو راف نشط بشكل أساسي 1. تشير الدوائر والمستطيلات إلى الخلايا المتمايزة وغير المتمايزة على التوالي. يوضح هذا الرسم البياني نسب التمايز لخلايا PC12 التي تم نقلها باستخدام CA-Raf1 ، ويتم نقلها بشكل مشترك مع CRY2 mCherry raf1 و CIBN GFP Caax وتم نقلها منفردة باستخدام CRY2A 2CIBN.

أظهرت الخلايا المعرضة للضوء الأزرق فقط تمايزا كبيرا. توضح هذه الصورة مورفولوجيا أجنة Xenopus الطبيعية بدون حقن MRNA وبدون علاجات ضوئية. تظهر هذه الصورة أجنة تم حقنها ب CRY2 2A2CIBN MRNA وتعرضت لتحفيز الضوء الأزرق.

يؤدي تنشيط raf1 عن طريق معالجة الأجنة المحقونة CRY2 2A2CIBN بالضوء الأزرق إلى تحفيز هياكل شبيهة بالذيل خارج الرحم في منطقة الرأس. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمرء الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيف ينظم التنشيط المحدد للمرحلة لمسار بروتين كيناز المنشط بالميتوجين التعبير الجيني. يمكن تعميم طريقة البصريات الوراثية هذه للتحكم في مسارات الإشارات الأخرى بآليات تنشيط مماثلة.