إطار منهجي موحد لبحوث شفاني الدهليزي

الهدف العام من هذا الإجراء هو معالجة عينة من الورم الشواني الدهليزي البشري تم استلامها من غرفة العمليات لغرض الزرع الخلوي الأولي وجمع إفرازات الورم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث الورم الشواني الدهليزي، مثل أفضل السبل لاستلام وتخزين ومعالجة عينة ورم بشري أولي مخصصة للاستخدام في مقالات بيومزيولوجية متعددة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تستخدم طريقة زرع ذات تدخل أدنى لإكثار خلايا الورم الشواني الدهليزي البشري الأولية.

تمتد آثار هذه التقنية لتشمل علاج الورم الشواني الدهليزي، حيث يمكن اختبار المرشحين العلاجيين الواعدين مباشرة على الخلايا المستزرعة. ابدأ بنقل وعاء العينة الذي يحتوي على عينة الورم الشواني الدهليزي أو العصب الأذني الكبير التي تم جمعها حديثاً من الثلج المستخدم للنقل من غرفة العمليات إلى غطاء التدفق الصفائحي في المختبر. استخدم ملاقط معقمة لنقل العينة بعناية إلى الأنبوب الأول من بين ثلاثة أنابيب سعة 1.5 milliliter مملوءة بـ 1.4 milliliters من محلول PBS الخارجي.

أغلق كل أنبوب بمجرد وضع العينة بداخله ورجّه برفق للغسل. ضع العينة في طبق بتري جاف بقطر 60 مليمتر واستخدم الملقط لإزالة جميع الأنسجة الميتة في المناطق التي تظهر بها أوعية دموية بارزة. استخدم الملقط أو شفرة المشرط لتقسيم العينة إلى قطع منفصلة للحفاظ على RNA، واستخلاص البروتين، وجمع الإفرازات، والتثبيت، وزراعة الخلايا.

انقل قطعة العينة المخصصة للمزرعة الخلوية إلى طبق مزرعة جديد بحجم 60 مليمتر يحتوي على خمسة إلى ثمانية مليلترات من وسط DMEM F12 المكمل والبارد. ضع قطعة الورم الشواني الدهليزي أو العصب الأذني الكبير المخصصة لجمع الإفرازات في أنبوب فارغ بحجم 1.5 مليلتر. ابدأ بسحب 500 ميكرولتر من وسط DMEM غير المكمل بـ FBS، وتوزيعها في أنبوبين بحجم 1.5 مليلتر.

ستُستخدم الأنبوبة الأولى لجمع إفرازات الورم، بينما ستكون الأنبوبة الثانية بمثابة ضابط مطابق. ضع إحدى الأنابيب التي تحتوي على DMEM على ميزان رقمي مُعاير. قم بتصفير الميزان، ثم ضع قطعة العينة المخصصة لجمع الإفرازات في الأنبوبة وقم بوزنها.

سجّل النتيجة، والتي ستمثل وزن النسيج وحده. تحت غطاء التدفق الصفائحي، اضبط حجم DMEM في الأنبوب ليكون 100 microliters لكل 10 milligrams من العينة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على عينة النسيج وعينة الضابط المطابقة لها في الحاضنة.

يتم التحضين لمدة 72 ساعة على الأقل، لجمع كميات مفيدة بيولوجياً من إفرازات الورم أو الأعصاب. وبعد التحضين لمدة 72 ساعة، تُستخدم ماصة سعة 1 مل لإزالة الوسط الذي يحتوي على الإفرازات من العينة. ولمنع تكرار دورات التجميد والإذابة، يتم تقسيم الوسط إلى حصص في أنابيب جديدة وفقاً للتحليلات اللاحقة المخطط لها.

قم بتخزين قطعة النسيج الأصلية والإفرازات ووسط DMEM الضابط في مجمد عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى بدء التطبيقات اللاحقة. ابدأ إجراءات الزراعة باستخدام ملقط في كل يد لفصل نسيج الورم الشواني الدهليزي إلى قطع بحجم 1 مليمتر مكعب تقريباً. بعد ذلك، اسحب الوسط وقطع الورم باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 10 مليمتر وانقل جميع المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليمتر.

قم بإجراء الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 1000G وبدرجة حرارة 25 درجة سيليزية. وأثناء عملية الطرد المركزي، قم بتحضير وسط التفكيك عن طريق دمج 4.7 milliliters من وسط DMEM F12 المكمل مع 250 microliters من الكولاجيناز و 50 microliters من الهيالورونيداز في طبق زراعة بقطر 60 millimeter. وبعد انتهاء الطرد المركزي، ستشكل قطع الورم قرصاً في قاع الأنبوب المخروطي.

اسحب السائل الطافي بعناية باستخدام الماصة وتخلص منه. ثم أضف 2 milliliters من وسط التفكيك المحتوي على الإنزيم المُحضّر حديثاً إلى سقف الورم. قم بعملية السحب والضخ بالماصة عدة مرات لتحريك النسيج، ثم انقله إلى طبق زراعة بمقاس 60 millimeter.

ضع طبق المزرعة في الحاضنة لمدة 18 ساعة، وفي اليوم التالي، قم بتدفئة وسط DMEM F12 المكمل بـ 10%FBS و1%penicillin streptomycin في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. أخرج الطبق الذي يحتوي على مزرعة الورم الشواني الدهليزي من الحاضنة وانقله إلى غطاء التدفق الصفحي. وباستخدام إبرة قياس 22 الملحقة بمحقنة سعة 6 مل، قم بشفط الوسط الذي يحتوي على المزرعة وانقله إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.

قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1000G ودرجة حرارة 37 degree celsius. وفي هذه الأثناء، استخدم ملقطاً معقماً لوضع العدد المطلوب من شرائح التغطية الزجاجية المطلية بالـ polydelycine والـ laminin في طبق زراعة مكون من 24 بئراً. يمكن زراعة من 24 إلى 32 بئراً من ورم بحجم مكعب واحد سنتيمتر، لذا فإن التخطيط لزراعة خلايا في ثمانية إلى 16 بئراً يعد مناسباً لمعظم الأورام الأصغر حجماً.

بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا المتبقية في الوسط المجهز مسبقاً، بحيث يتوفر ملليلتر واحد من معلق الخلايا لكل بئر مخطط له. استخدم ماصة سيرولوجية سعة خمسة ملليلتر لسحب ملليلترين من معلق الخلايا وضع ملليلتر واحد في بئر من لوحة الـ 24 بئراً. استمر في سحب وإيداع الوسط الذي يحتوي على الخلايا الورمية، بسحب زيادات قدرها ملليلتران يتم توزيع ملليلتر واحد منها في كل بئر مخطط له، حتى يتم تقسيم معلق الخلايا الورمية بالتساوي بين جميع الآبار المجهزة.

ضع الطبق المكون من 24 بئراً في الحاضنة عند درجة حرارة 37 degree celsius طوال الليل. افحص الطبق في اليوم التالي، وإذا لوحظ وجود حطام كبير في قاع الآبار، فقم بتغيير الوسط في كل بئر بعناية إلى وسط DMEM F12 استنباتي مُكمل جديد، مع الحرص على عدم تحريك الخلايا الملتصقة. وفي حال عدم وجود حطام، أعد الطبق إلى الحاضنة وقم بتغيير الوسط لأول مرة في اليوم الخامس، ثم كل ثلاثة أيام بعد ذلك.

توضح هذه الصورة المجهرية بالضوء الساطع النمط التنظيمي النموذجي لخلايا الورم الشواني الدهليزي في المزرعة. تم التقاط هذه الصور ذات الفلورية المناعية لمزرعة أولية من الورم الشواني الدهليزي البشري بعد 48 ساعة من التعرض لـ ink 80 المعبر عن GFP، والذي يظهر باللون الأخضر. أما الفلورية الحمراء فهي ناتجة عن صبغ الفلوريد المناعي لـ F actin باستخدام phalloidin، وهو الذي يصبغ الهيكل الخلوي، بينما تمثل الفلورية الزرقاء صبغة dapi التي تصبغ النواة.

تُظهر الصورة المدرجة تكبيراً أعلى لمنطقة من الصورة ذات القوة المنخفضة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تدوين الأوقات التي وضعت فيها عينة الإفراز وعينة المزرعة في الحاضنة، لضمان اتباع الخطوات اللاحقة بعد فترات التحضين الصحيحة. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التنادل الفيروسي، والتثبيت، والومضان المناعي، والمعالجة الدوائية، واستخلاص RNA للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تعبير الفيروسات المختلفة في الخلايا أو كيفية تغير التعبير الجيني بعد المعالجة الدوائية.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث الورم الشواني الدهليزي لاستكشاف كيفية استجابة الخلايا البشرية الأولية للأدوية المختلفة لدى المرضى الأحياء الذين خضعوا للجراحة.