خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

الهدف العام من اختبار AMP الدوري عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي هو فحص الروائح الكريهة ضد مستقبلات الرائحة والعكس صحيح. نظرا لأن الفئران مفيدة للتحقيق في عمل مستقبلات الرائحة من حيث أنها تسمح بإجراء فحوصات على نطاق أوسع لكل من مستقبلات الرائحة والروابط بالإضافة إلى التخريفات الدوائية لأزواج المستقبلات والترابط ذات الأهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تقييم تنشيط الرائحة إلى المستقبل بكفاءة وموثوقية.

نظام التعبير عن الرائحة غير المتجانسة إلى المستقبل باستخدام الخلايا الحية. ابدأ بمراقبة خلايا Hana3A تحت مجهر تباين الطور لضمان بقاء الخلية وتقدير التقاء. ثم استنشق كل الوسائط من طبق زراعة الخلايا.

وغسل الخلايا عن طريق إضافة 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات على الطبق ، وتحريك الطبق ، وشفط PBS. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.5٪ تريبسين-EDTA على الطبق. اترك التربسين على الخلايا لمدة دقيقة واحدة أو حتى تطفو جميع الخلايا.

قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 5 ملليلتر من MEM مع 10٪ FBS وسحب العينة لأعلى ولأسفل لتفتيت أجزاء من كتلة الخلية. بعد إجراء عد الخلايا ، انقل 2 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل صفيحة 96 بئرا ليتم نقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. من المهم أن تحسب العدد الصحيح للخلايا التي يجب تحضيرها على صفيحة 96 بئرا لتجنب فرط أو نقص نمو الخلايا قبل التحفيز.

الطرد المركزي الأنابيب عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم استنشاق المادة الطافية دون إزعاج منصة الخلية. أضف ستة ملليلتر من الوسط بدون مضادات حيوية لكل صفيحة مكونة من 96 بئرا وماصة لأعلى ولأسفل دون تكوين فقاعات هواء لتفتيت أجزاء من كتلة الخلية.

انقل الخلايا العالقة إلى خزان. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإدخال 50 ميكرولترا من الخلايا في كل بئر من الألواح المكونة من 96 بئرا. احتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قبل التعدي ، راقب الخلايا المطلية تحت مجهر تباين الطور لضمان التقاء مناسب من حوالي 30 إلى 50٪ لكل بئر ثم العودة إلى الحاضنة. اتبع بنية الصف الموسومة من رائحة إلى مستقبل، وتركيبات عامل الملحق، وبنية متغير المستشعر الحيوي AMP الدوري. ثم قم بإعداد خليط تعداء البلازما في 500 ميكرولتر من MEM لكل طبق 96 بئرا.

بعد ذلك ، قم بإعداد خليط تعداء يحتوي على 18 ميكرولترا من كاشف التعداء بوساطة الدهون في 500 ميكرولتر من MEM. اخلطي خليط التعداء مع خليط البلازما عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، أوقف التفاعل بإضافة 5 ملليلتر من MEM مع 10٪ FBS إلى مزيج التعداد. بعد ذلك ، انشر طبقة سميكة من المناشف الورقية المعقمة في غطاء مزرعة الخلية. خذ طبقا من 96 بئرا به خلايا من الحاضنة.

برفق وبشكل متكرر ، اضغط على اللوحة رأسا على عقب على كومة المناشف الورقية بحيث تمتص المنشفة الورقية الوسيط بالكامل. انقل 50 ميكرولترا من خليط التعداء المركب إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واحتضانها طوال الليل لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يمكنك إدارة التعدي ويجب أن يستمر جدول التحفيز على الأداة لأكثر من لوحة واحدة مكونة من 96 بئرا يتم اختبارها في تجربة واحدة بحيث يتم عكس جميع الألواح بعد نفس فترة التعرض للتعداء والمقطرات.

قبل التحفيز ، راقب الخلايا المنقولة تحت مجهر تباين الطور لضمان التقاء مناسب من 50 إلى 80٪ لكل بئر قبل العودة إلى الحاضنة. ثم قم بإعداد وسط التحفيز عن طريق إضافة 10 أكوام مللي مولار وخمسة مللي مولار جلوكوز إلى محلول الملح المتوازن من هانكس. قم بإذابة 55 ميكرولترا من الكاشف الركيزة لفحص AMP الدوري في الوقت الفعلي على الجليد.

قم بإعداد محلول ابتريشن متساو بنسبة 2٪ عن طريق خلط 55 ميكرولتر من كاشف الركيزة و 2،750 ميكرولتر من وسط التحفيز. بعد نشر طبقة سميكة من المناشف الورقية على المقعد ، اضغط برفق وبشكل متكرر على اللوحة رأسا على عقب على المناشف الورقية حتى تمتص المناشف الورقية وسط التعداد. اغسل الخلايا عن طريق سحب 50 ميكرولتر من وسط التحفيز لكل بئر.

اضغط برفق وبشكل متكرر على وسط التحفيز من اللوحة المكونة من 96 بئرا. ماصة 25 ميكرولتر من محلول توازن 2٪ في كل بئر وتحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين. قبل نهاية وقت الحضانة ، قم بتخفيف محاليل مخزون الرائحة المذابة لتركيز العمل ووسط التحفيز.

قبل إضافة الرائحة ، استخدم قارئ لوحة التلألؤ الكيميائي لقياس مستوى اللمعان القاعدي للوحة. قم بإزالة اللوحة بسرعة من قارئ اللوحة وأضف 25 ميكرولترا من تخفيفات الرائحة إلى كل بئر. ثم ابدأ على الفور في قياس التلألؤ المستمر لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة.

تم فحص 379 مستقبلا فريدا للرائحة البشرية مقابل 30 ميكرومولار موسكون باستخدام مقايسة AMP الدورية في الوقت الفعلي. تشير الكتل الملونة على طول المحور X إلى عائلات مستقبلات الروائح البشرية المختلفة. يمثل المحور Y التلألؤ الطبيعي بعد 30 دقيقة من إضافة الرائحة عندما تصل الاستجابة إلى الحد الأقصى للتحكم الإيجابي.

يشار إلى استجابة OR5AN1. يوضح هذا الشكل قياسات في الوقت الفعلي لتنشيط OR5AN1 بتركيزات مختلفة من المسكون ونتيجة التحكم السلبي بدون رائحة. يشير السهم إلى النقطة الزمنية لإضافة المسارات.

هنا ، يظهر منحنى استجابة تركيز OR5AN1 ضد المسكون بعد 30 دقيقة من إضافة المساكن. تستغرق التقنية الموضحة هنا ما مجموعه ثلاثة أيام بدءا من لوحة مخزون من طبقات الثقافة في اليوم الأول. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال العملية في اليوم الأخير في غضون ثلاث ساعات لكل لوحة مكونة من 96 بئرا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إدارة تنشيط مستقبلات oderant باستخدام اختبار AMP الدوري لتسخير النتائج.