مقايسة تثبيط (مرحبا) هيماجلوتينيشن أمثل لقياس الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا التتر
ديسمبر 1, 2017
البروتوكولات المقدمة تصف كيفية القيام مقايسة تثبيط hemagglutination كمياً التتر الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا من عينات المصل من المستلمين لقاح الإنفلونزا. الفحص الأول يحدد التركيزات المثلى مستضد الفيروسية بواسطة hemagglutination. الفحص الثاني يوضحها التتر الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا بتثبيط هيماجلوتينيشن.
الهدف العام من مقايسة تثبيط التلازن الدموي هذه هو قياس عيارات الأجسام المضادة ضد فيروسات محددة ذات أهمية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم اللقاحات حول المناعة والوقاية التي يوفرها اللقاح ضمن مجموعات سكانية مختلفة وعبر مختلف الفئات العمرية ومجموعات المرضى. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في دقتها وسرعتها في تحديد عيار وجود الأجسام المضادة المحيدة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول عيارات الأجسام المضادة البشرية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل عيارات الأجسام المضادة لمصل الفأر، وكذلك السوائل الطافية للمزارع الخلوية. ابدأ بتسمية ألواح المعايرة الدقيقة ذات الـ 96 بئراً بمعلومات التجربة المناسبة. ثم ضع اللوح في وضع رأسي واستخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 25 µL من PBS إلى كل بئر، باستثناء البئر الأول من صف المعايرة الخلفي السفلي.
أضف 50 µL من محلول المستضد المطلوب الذي تم تحضيره حديثاً إلى البئر الأول من صف المعايرة العكسية، يليه إضافة 25 µL من عينات المصل المعالجة بـ RDE إلى الآبار الأولى من الصفوف العشرة العليا. أضف 25 µL من المصل المضاد المناسب إلى البئر الأول من الصف الحادي عشر كعينة ضابطة موجبة. ثم انقل 25 µL من البئر الأول من كل صف إلى الآبار التالية لإجراء تخفيفات تسلسلية بمعامل تضاعف ثنائي.
قم بالماصة صعوداً وهبوطاً من 10 إلى 15 مرة لكل خطوة تخفيف، مع التخلص من آخر 25 µL من الآبار الأخيرة. بعد ذلك، أضف 25 µL من محلول المستضد إلى كل بئر من الصفوف من واحد إلى 11، و25 µL من PBS فقط إلى كل بئر في صف المعايرة العكسية. انقر على الصفيحة بعناية 10 مرات من جميع الجوانب الأربعة للمزج.
ثم قم بتغطية الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة الحضن، أضف 50 µL من محلول خلايا الدم الحمراء إلى كل بئر وقم بمزج الطبق عن طريق النقر عليه مجددًا. بعد ذلك، قم بتغطية الطبق مرة أخرى واحضن خلايا الدم الحمراء وفقًا للنوع المستخدم كما هو موضح في الجدول.
بعد إضافة خلايا الدم الحمراء إلى الطبق، التزم بوقت الحضن المناسب لنوع الدم المستخدم في المقايسة. إذ سيؤدي الحضن لفترة قصيرة جدًا أو طويلة جدًا إلى تفسير غير صحيح للنتائج. وفي نهاية فترة الحضن، قم بتقييم التلازن الدموي عن طريق إمالة الطبق بزاوية 90 درجة لمدة 25 ثانية، وسجل النتائج لكل بئر، بينما لا يزال الطبق مائلًا، على مخطط مطبوع لطبق الـ 96 بئرًا.
في هذه التجربة، تم تقييم الاستجابة للأجسام المضادة المستحثة باللقاح لدى 26 متطوعاً سليماً تلقوا لقاحاً ثلاثياً غير نشط ضد الإنفلونزا يحتوي على سلالات influenza A/H1N1/California/2009 وA/H3N2/Texas/2012 وB/Massachusetts/O2/2012 قبل موسم الإنفلونزا لعام 2015. وقد لوحظت استجابة مناعية متصالبة لسلالات الفيروس A/H3N2/Switzerland/2013 وA/H3N2/Texas/2012، مع انخفاض ملحوظ في المتوسط الهندسي لعيارات تثبيط تراص الدم (hemagglutination inhibition titers) والحماية المصلية المستحثة ضد influenza A/H3N2/Switzerland/2013 مقارنة بـ influenza A/H3N2/Texas/2012. وبعد التطعيم، ارتفعت عيارات الأجسام المضادة ضد كلتا السلالتين، على الرغم من أن سلالة A/H3N2/Switzerland/2013 لم تكن موجودة في اللقاح.
يُظهر الهيماجلوتينين الفيروسي قدرة على تلاؤم كريات الدم الحمراء تعتمد على النوع. ومن المثير للاهتمام أن دم خنزير غينيا لا يتلاؤم بشكل صحيح مع إنفلونزا B، بينما يمتلك دم الديك الرومي قدرة على التلاؤم بعيارات عالية وتفاعل تضاد منخفض. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.
أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر معالجة المصل باستخدام RDE لتعطيل أي مثبطات غير نوعية والارتباط غير النوعي أثناء عملية تراص الدم للفيروس. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل ELISA للإجابة على أسئلة إضافية حول دور الغلوبولينات المناعية النوعية لكل مسبب مرض على حدة. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الفيروسية لتعميق فهمنا للمناعة المرتبطة باللقاحات لدى المرضى الأصحاء ومن يعانون من نقص المناعة ضمن مختلف الفئات العمرية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء مقايسة تثبيط تراص كريات الدم الحمراء لتقدير عيارات الأجسام المضادة النوعية لسلالة الإنفلونزا على نطاق واسع. لا تنسَ أن العمل مع المستضدات الفيروسية، ودماء الحيوانات، وعينات المصل البشري يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، وأنه يجب دائمًا اتخاذ احتياطات مثل العمل في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية BSL2 أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تعرض هذه المقالة بروتوكولات لإجراء مقايسة تثبيط التلازن الدموي لتقدير عيارات الأجسام المضادة النوعية للإنفلونزا من عينات المصل. وتعد هذه الطريقة ضرورية لفهم المناعة المكتسبة عن طريق اللقاحات لدى المجموعات السكانية المختلفة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم اللقاحات
- علم المناعة
- علم المصل
خلفية علمية
- يقيس اختبار تثبيط تراص كريات الدم الحمراء الاستجابات الجسمية المضادة للإنفلونزا.
- يوفر هذا الاختبار رؤى حول فعالية اللقاح والمناعة السكانية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع مختلفة من العينات، بما في ذلك مصل الإنسان والفأر.
- يعد فهم عيارات الأجسام المضادة أمراً ضرورياً لتقييم أداء اللقاح.
الغرض من الدراسة
- لقياس عيارات الأجسام المضادة النوعية للإنفلونزا لدى متلقي اللقاح.
- لتقييم الاستجابة المناعية عبر مختلف الفئات الديموغرافية.
- لتوفير طريقة سريعة ودقيقة لتحديد العيارات.
الطرق المستخدمة
- توسيم ألواح معايرة دقيقة ذات 96 بئراً بالمعلومات التجريبية.
- استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة PBS إلى الآبار.
- إجراء اختبار التلازن الدموي لتحديد التركيزات المثلى للمستضد الفيروسي.
- إجراء اختبار تثبيط التلازن الدموي لقياس عيارات الأجسام المضادة.
النتائج الرئيسية
- يقوم هذا المقايسة بتحديد كمي دقيق لعيارات الأجسام المضادة ضد الإنفلونزا.
- تثبت المقايسة وجود أجسام مضادة معادلة في عينات المصل.
- يمكن أن تسهم النتائج في توجيه تطوير اللقاحات واستراتيجيات الصحة العامة.
- تتميز هذه الطريقة بقابليتها للتكيف مع مختلف أنواع العينات والمجموعات السكانية.
الاستنتاجات
- يُعد مقايسة تثبيط التراص الدموي أداة موثوقة لقياس الاستجابات المناعية.
- تعزز هذه التقنية من فهم المناعة المستحثة باللقاح.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية لتشمل الإصابات الفيروسية والمجموعات السكانية الأخرى.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُعد التحديد الكمي الدقيق لعيارات الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا أمراً ضرورياً لتقييم المناعة المستحثة باللقاح وتوجيه تقييمات الاستمناع في مراحل التطوير قبل السريرية والسريرية. ويوفر اختبار تثبيط التلازن الدموي (HI) طريقة قياسية وسريعة لقياس استجابات الأجسام المضادة المُحيّدة عبر مجموعات سكانية متنوعة، مما يدعم اتخاذ قرارات "المضي قدماً أو التوقف" بناءً على البيانات في تطوير سلسلة لقاحات. ومن خلال تمكين تحليل التفاعل التبادلي بين السلالات وتحسين استخدام كريات الدم الحمراء الخاصة بكل نوع، يعزز هذا الاختبار الثقة التنبؤية في دراسات المناعة الترجمية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الاستجابات المناعية الناجمة عن اللقاح من خلال قياس عيارات الأجسام المضادة النوعية للسلالة، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية للأهداف المستضدية.
- القيمة التشغيلية: تمكين التحقق الوظيفي من الهيماجلوتينين كمستضد رئيسي للإنفلونزا من خلال تثبيط التراص الفيروسي.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توحيد تركيزات المستضد من خلال معايرة التراص الدموي (HA)، مما يضمن مدخلات قابلة للتكرار لفحص التثبيط التراصي (HI) اللاحق.
- القيمة التشغيلية: دعم فحص المصل عالي الإنتاجية باستخدام تخفيفات متسلسلة بمقدار ضعفين في تنسيق 96 بئراً، مما يحسن من قابلية توسع المقايسة.
- القيمة العلمية: تقليل التفاعل المتصالب من خلال الاختيار التجريبي لخلايا الدم الحمراء الحيوانية (مثل خنزير غينيا، الديك الرومي)، مما يعزز خصوصية المقايسة لفيروس الإنفلونزا B والسلالات غير المتجانسة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: قياس الحماية المصلية المستحثة باللقاح والمتوسطات الهندسية للعيارات (GMTs) في مجموعات صحية، مما يوفر مؤشرات حيوية ترجمية للاستجابة المناعية.
- القيمة التشغيلية: تتيح إجراء مقارنة متداخلة الوظائف للاستجابات المناعية عبر الفئات العمرية ومجتمعات المرضى باستخدام حدود قطع معيارية للعيارات.
- القيمة العلمية: الكشف عن الاستجابات المناعية ذات التفاعل المتقاطع مع السلالات غير المشمولة في اللقاح (مثل A/H3N2/Switzerland/2013)، مما يساهم في تصميم لقاحات واسعة الطيف.
تكامل مسارات العمل والتدفقات
يندرج مقايسة تثبيط الدم (HI assay) ضمن سير عمل دراسة الاستجابة المناعية بدءاً من مرحلة الاكتشاف المبكر وصولاً إلى التحقق من الصحة قبل السريرية، حيث توفر بيانات كمية عن الأجسام المضادة تساهم في توجيه عملية اختيار المستضد، وتحسين المواد المساعدة، ودراسات تحديد نطاق الجرعات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بفعالية اللقاح من خلال قياس التثبيط الوظيفي للأجسام المضادة لعملية التراص الدموي.
- الفحص المسحي: توفر مخرجات كمية وقابلة للتكرار للعيارات من خلال التخفيفات المتسلسلة، مما يتيح تقييماً موثوقاً للمركبات أو اللقاحات المرشحة.
- التحليلات: تولد عيارات نهائية ومتوسطات هندسية تسمح بالمقارنة الإحصائية للاستجابات المناعية عبر المجموعات التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تقييم الاستمناع في النماذج الحيوانية (مثل مصل الفئران) قبل إجراء التجارب البشرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة مصلية موحدة قابلة للتطبيق على سلالات متعددة من الإنفلونزا وتنسيقات مختلفة للقاحات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في المناعة المستحثة باللقاح من خلال قياس عيارات الأجسام المضادة المعادلة كدليل ارتباط للحماية.
- القيمة التشغيلية: تضمن تكرار المقايسة من خلال تحضير مستضدات معياري، واستخدام مصل معالج بـ RDE، وأوقات حضانة محددة لخلايا الدم الحمراء لكل نوع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال التحديد المبكر لعدم كفاية الاستمناع، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على محفظة المنتجات: تمكن من تحديد أولويات اللقاحات المرشحة بناءً على تعديل المخاطر، وذلك استناداً إلى اتساع عيارات الأجسام المضادة عبر السلالات ومعدلات الحماية المصلية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الفيروسات وعلم المصل للتعامل مع المستضدات الفيروسية، وتحضير المصل المعالج بـ RDE، وتفسير نقاط نهاية التلازن الدموي.
- يعتمد على توفر مرافق متوافقة مع مستوى السلامة البيولوجية الثاني BSL2 للتعامل الآمن مع فيروسات الإنفلونزا ومنتجات الدم البشرية والحيوانية.
- يستلزم توحيد مصادر كريات الدم الحمراء (على سبيل المثال: خنزير غينيا، الديك الرومي، البشر من الفصيلة O) لتقليل التفاعلية المتقاطعة وضمان حدوث التلازن الخاص بالنوع.
- يتطلب ضوابط زمنية دقيقة أثناء تحضين كريات الدم الحمراء لتجنب قراءات التلازن الدموي السلبية الكاذبة أو الإيجابية الكاذبة.
- يقتصر على قياس نشاط الأجسام المضادة الوظيفي؛ ولا يقوم بكمية فئات الغلوبولين المناعي غير المُحيّدة أو غير الوظيفية دون استخدام مقاييس تكميلية (مثل ELISA).
![تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال في المختبر](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55376.jpg%3Fv%3D2026-08-27T10%253A30%253A16.000Z&w=384&q=75)
