Name: إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: تعلم بروتوكول تجزئة لإثراء مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة التراكمات البروتينية المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون الدكتور جيم لاه وليفي الآن، إدارة أموري لطب الأعصاب، اقتراحات وتعليقات مفيدة. تم تمويل هذا العمل جزئيا "التعجيل بالشراكة الطب" المنحة (U01AG046161-02)، مرض الزهايمر أموري لمنح مركز بحوث الأمراض (P50AG025688) والمعهد الوطني الشيخوخة (R01AG053960-01) إلى N.T.S. هذا البحث أيضا تدعمها جزئيا "جوهر" المنحة "أموري علم الأعصاب NINDS المرافق الأساسية"، P30NS055077 أمراض الأعصاب.

"بيان الأخلاق": تم الحصول على جميع أنسجة الدماغ من مرض الزهايمر أموري &#39; s المرض مركز البحوث (أدرك) المخ البنك. الأنسجة البشرية تشريح الجثة تم الحصول عليها تحت السليم المؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) البروتوكولات.
 1. التجانس ووجود <ol><li>اختيار الأنسجة ملاحظة: تجميد أنسجة اللحاء أمامي تشريح الجثة من مراقبة صحية (Ctl) ومرضية اختيرت الإعلانية الحالات المؤكدة أموري بنك أدرك الدماغ (n = 2). أجرى تقييم توزيع البلاك اميلويد لاثيل الجثة وفقا للاتحاد إنشاء سجل لمرض الزهايمر &#39; s المرض شبه كمي سجل 24 من المعايير، على الرغم من أن وقيمت متشابكة نيوروفيبريلاري علم الأمراض وفقا لنظام التدريج براك. وأكد 16 <ol><li>الحصول على تجميد أنسجة المخ تشريح الجثة من مراقبة صحية (Ctl) ومرضية الحالات الإعلانية. استخدام حاويات الثلج الجاف وملقط وشفرة حلاقة، المكوس ~ تزن 250 ملغ أجزاء من المادة الرمادية من كل عينة الأنسجة على المتاح تريد القوارب، مع الحرص على منع الأنسجة من ذوبان الجليد. تسجيل وزن كل قطعة أن تجانس.</li>
		<li>المكوس ~ 250 ملغ المادة الرمادية باستخدام الملقط وأسلاك شائكة بتفتيش بصريا لتحديد العلاقة بين المادة الرمادية الخارجي والداخلي الأبيض المسألة. تجنب هذه المسألة الأبيض، والأهم من ذلك، أي الأوعية الدموية الكبيرة أو في مناطق الدموي أو السحايا ماطر العنكبوتي. الحفاظ على الأنسجة المجمدة أثناء عملية القطع بالعمل بسرعة، وكثيراً ما وضع قارب وزنها مع أنسجة المخ في حاويات البوليستيرين مع مدت الجافة</li>
		<li>سجل الوزن الدقيق للمادة الرمادية التي اقتطعت من كل قطعة مجمدة باستخدام رصيد التحليلي. حساب حجم المخزن المؤقت منخفضة الملح (LS) (انظر الجدول 1) اللازمة لتجانس دونس (5 مل/g أو 20% w/v)-</li>
		<li>إعداد 10 مل LS المخزن المؤقت مع 1 × مثبطات البروتياز والفوسفاتيز كوكتيل والبرد على مدت</li>
		<li>إزالة الأنسجة وزنه وقارب وزنها من الثلج الجاف والزهر أربا 2 × 2 مم تقريبا كما أنه يذوب. نقل إلى أنبوب الخالطون دونس برود قبل 2 مل على مدت</li>
		<li>إضافة 5 مل/ز (20% w/v) من المخزن المؤقت المثلج الملح منخفضة (LS) مع 1 × مثبطات البروتياز والفوسفاتيز كوكتيل.</li>
		<li>هوموجينيزي أنسجة المخ على الجليد باستخدام حوالي 10 السكتات الدماغية التخليص عالية مدقة أ والسكتات الدماغية 15 من تطهير منخفض مدقة باء</li>
		<li>نقل جميع هوموجيناتي إلى أنبوب البولي بروبيلين 2 مل استخدام زجاج ماصة باستور. قم بتسمية الأنبوب مع &#8220; ال &#8221; (مجموع هوموجيناتي)، الأنسجة القضية وعدد هوموجيناتي حجم. قاسمة 0.8 مل في أنبوب مسمى 1.5 مل. يمكن أن يكون أي هوموجيناتي الزائدة وبالمثل اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية.</li>
		<li>لكل مل 0.8 الكوة، إضافة 100 ميليلتر من كل 5 م كلوريد الصوديوم وساركوسيل 10% (w/v) إلى تركيزات 0.5 M و 1% w/v، على التوالي. مزج الأنابيب جيدا بانعكاس واحتضان على الجليد لأنابيب تسمية 15 دقيقة مع &#34; ال-S &#34; (مجموع هوموجيناتي-ساركوسيل) تشير إلى هوموجيناتيس في ساركوسيل-المخزن المؤقت (الجدول 1).</li>
		<li>Sonicate كل أنبوبة لنبضات ق 5 ثلاث في السعة 30% على الجليد (أقصى شدتها = 40%) باستخدام مسبار ميكروتيب.</li> <li>تحديد تركيزات البروتين هوموجيناتيس استخدام حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) الاعتداء 25 الأسلوب. 
		ملاحظة: يتم تركيز البروتين متوسط هوموجيناتيس ال ق أعد في مل 5 ليرة سورية كل غرام من النسيج 15-20 ملغ/مل. يمكن مجزأ مباشرة هوموجيناتيس أو تخزينها في-80 درجة مئوية حتى استخدام.</li>
		<li>Homogenates تمييع TH-S إلى 10 ملغ/مل باستخدام المخزن المؤقت لسارك المثلج (الجدول 1) مع 1 × مثبطات البروتياز والفوسفاتيز.</li>
		بروتين <li>نقل 5 ملغ (0.5 مل) من كل هوموجيناتي دا ال 500 ميليلتر البولي أولتراسينتريفوجي أنابيب وزوج-التوازن مع المخزن المؤقت سارك. تحميل أنابيب إلى الدوار قبل مبردة وأولتراسينتريفوجي في س 180,000 ز لمدة 30 دقيقة في supernatants نقل للذوبان ساركوسيل درجة مئوية. 4 (S1) إلى أنابيب 1.5 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية. 
		ملاحظة: (أغسل اختياري) إضافة 200 ميليلتر لسارك-المخزن المؤقت إلى أولتراسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على كسور تستعصي على الحل المنظفات (P1) وإزاحة الكريات (P1) من الجزء السفلي من الأنابيب أولتراسينتريفوجي استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر.</li>
		أنابيب <li>بإيجاز نبض-تدور المقلوب ل s 2-3 (&#8804; 2,500 ز س) في ميكروسينتريفوجي لنقل الكريات (P1) والعازلة للأنابيب 1.5 مل أدناه. ريسوسبيند الكريات (P1) غير قابلة للذوبان في سارك-المخزن المؤقت قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً لضمان تعطل بيليه.</li>
		<li>زوج-التوازن، وأجهزة الطرد المركزي في 180,000 س ز 30 دقيقة إضافية في 4 ° C.</li>
		<li>تجاهل المادة طافية يغسل الاختياري (S2) واحتضان الكريات تستعصي على الحل ساركوسيل (P2) في 50-75 ميليلتر من اليوريا المخزن المؤقت (الجدول 1) مع 1 × الموافقة المسبقة عن علم (مثبط البروتياز والفوسفاتيز كوكتيل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة جعل بيليه- 
		ملاحظة: اليوريا الحارة المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها لتجنب ترسيب الحزب الديمقراطي الصربي. تطبيقات حساسة للمنظفات، تجاهل الحزب الديمقراطي الصربي من المخزن المؤقت لليوريا وتنظر الغسيل بيليه (P2) غير قابلة للذوبان في المخزن المؤقت الملح منخفضة قبل ريسوسبيندينج في المخزن المؤقت لليوريا.</li>
		<li>نقل الكريات ريسوسبينديد (P2) إلى أنابيب 0.5 مل واستخدام موجز (1 s) سونيكيشن ميكروتيب في السعة 20% (أقصى شدتها = 40 ٪) جعل كامل الكريات.</li>
		<li>تحديد تركيزات بروتين قابل للذوبان ساركوسيل (S1)-والاعتداء الكسور (P2) غير قابلة للذوبان في اتفاق التعاون الأساسي باستخدام الأسلوب. استخدم هذه الكسور مباشرة أو تخزينها في-80 درجة مئوية حتى استخدام.</li>
	</ol></li></ol> 2. إيمونوبلوتينج <ol><li>النشاف الغربية ملاحظة: النشاف الغربية أجرى وفقا لإجراءات الإبلاغ عنها سابقا مع تعديلات طفيفة. 5 ، 10 <ol><li>إعداد 40 ميكروغرام عينات من مجموع هوموجيناتيس (TH-S) وسارك القابلة للذوبان (S1) وتستعصي على الحل سارك الكسور (P2) في المخزن المؤقت للعينة X لايملي الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 1 مع 5 مم تسيب الأس الهيدروجيني 7. احتضان عينات من 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5</li>
		هلام <li>تحميل عينات في الخرسانة الجاهزة 10-جيدا 4-12% مكررا-تريس الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. اليكتروفوريسي في 80 الخامس للسنتيمتر الأول (10 دقيقة) و 120 الخامس للفترة المتبقية (60 دقيقة) أو حتى صبغ تتبع تصل إلى الجزء السفلي من الجل.</li>
		<li>استخدام شفرة حلاقة جديدة وجل السكين إلى سبليت--فتح كاسيت جل مسبقة الصب. قص بلطف بعيداً الامشاط وأسفل جداً من الجل مع شفرة حلاقة جديدة-</li>
		<li>ريسوسبيند غير قابلة للذوبان الكريات (P1) في 200 ميليلتر سارك-المخزن المؤقت مع x 1 الموافقة المسبقة عن علم قبل بيبيتينج أعلى وأسفل.</li>
		<li>نقل إلى غشاء النيتروسليلوز 0.2 ميكرون باستخدام أسلوب نقل جافة على جهاز بلوتينج (انظر الجدول المواد)-</li>
		<li>كتلة الغشاء في حجب المخزن المؤقت (بب) دون توين 20 لمدة 30 دقيقة، تلت مع BB مع 0.05% 20 توين (BB/تي) لمدة 30 دقيقة. وبعد تجميد، شطف الغشاء في تبس/تي (0.1% 20 توين) لمدة 5 دقائق لإزالة المخزن المؤقت حظر الزائدة.</li>
		<li>تحضير 1:1,000 تخفيف من pT231 الأجسام المضادة الأولية، وتاو-2 (عموم تاو)، AT8 و EEA1 في BB/T (توين 0.05% 20)-</li>
		<li>احتضان الأغشية في حل جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الانفعالات دائرية. شطف الغشاء في تبس/تي ل 3 × 15 دقيقة</li>
		<li>مسبار الغشاء مع إضعاف 1:20,000 المسمى فلوريسسينتلي قرب الأشعة تحت الحمراء الثانوية جسم في BB/تي لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام على شاكر. شطف الغشاء 3 × 10 دقيقة في تبس/T ودقيقة 2 × 5 في tbs.</li>
		<li>مسح الغشاء باستخدام الأشعة تحت حمراء التصوير النظام في الطول الموجي الإثارة المناسبة (مثلاً 700 نانومتر (القناة الحمراء) للأشعة تحت الحمراء صبغ 680 الماعز الماوس المضادة مفتش (H + L) الثانوي و 800 نانومتر (قناة الأخضر) لصبغ الأشعة تحت الحمراء 790 حمار الأرنب المضادة IgG (H + L ) ثانوي)-</li>
		<li>استخدام برامج التصوير لقياس كثافة الإشارات وإجراء القياسات قياس كثافة حسب الشركة المصنعة &#39; تعليمات s، تأمين السيارات-خلفية الإعداد يتم تعيين إلى متوسط الخلفية كاملة-</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991(1991).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyloid+Beta+Peptide%3A+A+Chemist%27s+Perspective.+Role+in+Alzheimer%27s+and+Fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li>
<li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li>
<li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer%27s+Disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li>
<li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJulien%2C+C+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).</li>
<li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).</li>
<li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li>
<li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility%2C+including+A%CE%B2+but+not+tau%2C+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li>
<li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+%CE%B1-Synuclein+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+%CE%B1-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+%CE%B1-Synucleinopathy+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130(2006).</li>
<li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/29/1_Supplement/712.3">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1759558">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived%2C+Toxic%2C+High+Mass+Amyloid+%CE%B2-Protein+%28A%CE%B2%29+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li>
<li>Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+%28snRNPs%29+aggregate+in+Alzheimer%27s+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).</li>
<li>Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+change%2C+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li>
<li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer%27s+Disease+%28CERAD%29.+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer%27s+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li>
<li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subfraction+of+A%CE%B2+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هنا يمكننا إدخال ومناقشة بروتوكول المنظفات-تجزئة خطوة واحدة مختصرة التي تنطبق على مجموعة متنوعة من تطبيقات تجريبية تتراوح بين التحليل الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي البروتيوميات البروتين وظيفية misfolding فحوصات والنشاف الغربية. 5 , 6 , 7 , 10 هذه المنهجية ربما معظم فعالة عند استخدامها لدراسة بروتينوباثيس الأعصاب مثل الزهايمر والمرض، مرض هنتنغتون، أمراض بريون وتاوباثيس المختلفة. بالمقارنة ...

أمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض) وأمراض بريون وثيق الصلة بروتينوباثيس تتميز بتراكم تدريجي انخفاض المجاميع البروتين المنظفات الذوبان في الدماغ مع مرافقة المعرفية. 1 , ويعتقد أن تلعب دوراً مركزياً في المسببات والفيزيولوجيا المرضية لهذه الأمراض الأعصاب 2 هذه الميزة المرضية المشتركة. 2 هذه المجاميع وعادة ما تتألف من ألياف اميلويد البوليمرية، التي تتكون من تكرار وحدات من البروتين تجمعات العارضة عبر β-الهيكل. 1 , 2 , 3 , 4 المتحلل، المجاميع اميلويد هي شديدة المقاومة تمسخ الكيميائية أو الحرارية وسولوبيليزيشن،3 التي تشكل تحديات فريدة من نوعها لتنقية بهم، تحليل ودراسة عن طريق التقنيات الحيوية التقليدية. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 لا غرابة، الكسر البروتين تستعصي على الحل المنظفات قد تم تركيز الكثير من البحوث في الفسيولوجيا المرضية لأمراض الأعصاب التي تشمل تراكم البروتينات تجمعات. 6 , 12 , 13 , 14
كثيرا ما استخدمت تقنيات تجزئة البيوكيميائية لإثراء الكسر تستعصي على الحل المنظفات من homogenates الدماغ تشريح الجثة. 6 , 12 , 13 , 14 واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً يشمل استخراج متسلسلة من الأنسجة هوموجيناتيس مع المخازن المؤقتة والمنظفات الصناعية المتزايدة الصرامة، تليها تنبيذ فائق لتقسيم الكسور القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان. 6،بروتوكول14 تجزئة متسلسلة استخداماً ينطوي على تجانس عينات الأنسجة المجمدة في منطقة عازلة خالية من المنظفات منخفضة ملح (LS) والكريات الناتجة غير قابلة للذوبان ثم تستخرج تسلسلياً مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على الملح عالية، والمنظفات غير الأيونية، السكروز عالية، المنظفات الأيونية، وأخيراً تشاوتروبيس مثل اليوريا. 6 , 14 هو عيب واضح من هذه البروتوكولات تجزئة متسلسلة وقت كبير والتزام العمل المطلوب لإكمال لهم. بما في ذلك التجانس وتنبيذ فائق، يمكن اتخاذ بروتوكول نموذجي خمس خطوات تجزئة عدة ساعات أو حتى أيام لاستكمال. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 بالإضافة إلى ذلك، يظل العديد من البروتين باثولوجي المجاميع غير قابلة للذوبان في جميع ولكن ظروف أقسى19،20 معظم الكسور التي تم إنشاؤها ذات قيمة محدودة. وهكذا، خطوات تجزئة أقل صرامة استخدام تركيزات عالية من الملح والمنظفات غير الأيونية زائدة عن الحاجة إلى حد كبير.
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) مرشح ممتاز لبروتوكول مبسط تجزئة منظفات في خطوة واحدة. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 كمطهر يشوه، ساركوسيل صرامة ما يكفي جعل الغالبية العظمى من البروتينات مطوية أصلاً في الدماغ دون سولوبيليزينج المجاميع البروتين تجمعات تتألف من اميلويد بيتا (Aβ)،6،11 تاو فوسفوريلاتيد (بتاو)،6 "القطران الحمض النووي" ملزم بروتين 43 (ماساتشوستس-43)،14 ألفا-سينوكلين أو الرعاش13 12،،23 أو U1 الصغيرة النووية ريبونوكليوبروتينس (U1 سنرنبس) مثل U1-70 ك. 5 , 21 , 22 كما ساركوسيل أقل صرامة من كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظفات أنيونى في كل مكان (SDS)، فإنه يحافظ على أشكال oligomeric أقل متانة من المجاميع تجمعات البروتين التي لا يمكن أن تصمد أمام معاملة الحزب الديمقراطي الصربي. 9
سابقا، يمكننا وصف بروتوكولا المنظفات-تجزئة مختصر الذي حقق نتائج قابلة للمقارنة للمنهجيات تجزئة متسلسلة أكثر شاقة. 5 بحذف الخطوات تجزئة أقل صرامة، استطعنا أن وضع بروتوكول تجزئة خطوة واحدة سهلة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. 5 هذا البروتوكول التفصيلية الموضحة هنا مناسبة تماما لمجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية تتراوح من النشاف الغربية وفحوصات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي misfolding البروتين وظيفية والبذر التجميع. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز ، خال من EDTA (100X)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز</td></tr><tr><td>نظام Sonic Dismembrator System (الموجات فوق الصوتية)</td> <td>فيشر ساينتفيك</td><td>FB505110</td><td>ميكروتيب الموجات فوق الصوتية</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>الدوار المبرد بالطرد المركزي الفائق</td></tr><tr><td>TLA120.1</td><td>بيكمان كولتر</td><td>362224</td><td>دوار الطرد المركزي الفائق</td></tr><tr><td>500 ul (8 × 34 مم) أنابيب البولي كربونات ، أنابيب</td> الطرد المركزي الفائق الجدار <td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>لدوار TLA120.1</td></tr><tr><td>4X SDS عينة عازلة</td><td>محلية</td><td>الصنع N / A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP ، عامل اختزال الأس الهيدروجيني</td><td>المحايد Thermo Fisher</td><td>77720</td><td></td></tr> <tr><td>(TBS) مانع المخزن المؤقت</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>المخزن المؤقت للحجب</td></tr> <tr><td>(TBS) + 0.05٪ Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>مانع المخزن المؤقت والأجسام المضادة المخفف</td></tr><tr><td>4-12٪ المواد الهلامية Bolt Bis-Tris Plus ، 10 آبار</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>المواد الهلامية SDS-PAGE مسبقة الصب</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE قيد التشغيل عازلة</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم (sarkosyl)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>منظف</td></tr><tr><td>مضاد ل Tau-2 (بان تاو) الأجسام المضادة</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>المضادة للفوسفو ثريونين 231 الأجسام المضادة تاو</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>للفوسفو السيروين 202 والثريونين 205 تاو (AT8)</td> <td>الأجسام المضادة</td> <td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة للأجسام الداخلية المبكرة 1 (EEA1) الأجسام المضادة</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 الماعز المضادة للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>iBlot2 نظام النشاف الجاف</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>نقل الجل</td></tr><tr><td>iBlot2 مداخن النقل ، النيتروسليلوز ، ميني</td><td>نقل هلام IB23002 ثيرمو فيشر</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكولا يختصر خطوة واحدة تجزئة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) سولوبيليزيس فعالية البروتينات مطوية أصلاً في أنسجة المخ مما يسمح في إثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من طائفة واسعة من بروتينوباثيس الأعصاب، مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون والتصلب العضلي الجانبي وأمراض بريون. كانت سيطرة الإنسان وأنسجة المخ تشريح الجثة الإعلانية المتجانس ورسابه تنبيذ فائق حضور ساركوسيل لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات الصناعية بما في ذلك تاو فوسفوريلاتيد باثولوجي، العنصر الأساسي من نيوروفيبريلاري التشابك في الإعلان. النشاف الغربية أظهرت أن القابلية للذوبان التفاضلية تاو فوسفوريلاتيد مجمعة والبروتين للذوبان المنظفات، 1 مستضد دخلول المبكر (EEA1) في السيطرة والدماغ الإعلانية. كما كشف تحليل البروتين إثراء بيتا-اميلويد (Aβ)، تاو، snRNP70 (U1-70 ك)، والابوليبوبروتين ه (الذين) في كسور الدماغ الإعلانية مقارنة بتلك التي تحكم، تمشيا مع الاستراتيجيات السابقة في وجود أنسجة تستعصي على الحل ساركوسيل . وهكذا، هذا البروتوكول تخصيب بسيطة مثالية لمجموعة واسعة من تطبيقات تجريبية بدءاً من النشاف الغربية والبروتين وظيفية فحوصات التجميع المشارك البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي.

تم استخدام البروتوكول يختصر خطوة واحدة ساركوسيل-تجزئة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من التحكم والإعلانية تشريح الجثة الدماغ (الشكل 1). تم حل البروتينات من الكسور TH-S، S1، S2 و P2 بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ثابتة لمدة 15 دقيقة في أخذ المخزن المؤقت مثبت الأزرق متبوعاً تلطيخ لطيف مع "أخذ الأزرق الرائعة" G-250 المصبوغة المخزن المؤقت. الخطوة استثارة اختيارية نظراً لوجود مستويات غير قابلة للكشف للبروتين في الكسر S2 (انظر 1.1.14). <...

ويرد وصف بروتوكولا تجزئة مختصر لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة.

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

الهدف العام من بروتوكول التجزئة هذا هو إثراء تجمعات البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة الدماغ البشرية بعد الوفاة. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التنكس العصبي، مثل تحديد وتوصيف تجمعات البروتين سيئة الطي في المرض. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الإثراء والعزل السريع لتجمعات البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة الدماغ خلال إطار زمني قصير.ستقوم ترام نغوين، وهي فنية من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. احصل على أنسجة دماغية مجمدة بعد الوفاة من مجموعة ضابطة سليمة ومن حالات مؤكدة مرضياً للإصابة بمرض AD. استخدم الملاقط وشفرة حلاقة لاستئصال أجزاء تزن 250-milligram تقريباً من المادة الرمادية من كل عينة نسيجية. اترك قطعة الدماغ لتذوب لمدة دقيقة واحدة.الآن، قم بتقطيع قطعة من النسيج إلى مكعبات يبلغ حجمها حوالي 2 mm³ أثناء ذوبانها. انقل القطع إلى أنبوب تجانس Dounce سعة 2 mL مبرد مسبقاً وموضوع على الثلج. تذكر تجنب المادة البيضاء وأي أوعية دموية كبيرة.اعمل بسرعة وضع النسيج في قوارب وزن مخصصة للاستخدام مرة واحدة بعد تصفير الميزان. احرص على منع ذوبان النسيج عن طريق وضع قارب الوزن الذي يحتوي على نسيج الدماغ بشكل متكرر في حاويات بوليسترين تحتوي على ثلج جاف. بعد تشريح ووزن جميع قطع النسيج المطلوبة، أخرج قارب وزن يحتوي على قطعة من النسيج من الثلج الجاف.بعد ذلك، أضف خمسة مليليتر من محلول منظم منخفض الملوحة مبرد بالثلج مع مزيج مثبطات البروتياز والفوسفاتيز لكل جرام من النسيج، وقم بالتجانس على الثلج باستخدام حوالي 10 ضربات بمدقة عالية الخلوص (A) و15 ضربة بمدقة منخفضة الخلوص (B). ثم استخدم ماصة باستور زجاجية بطول تسع بوصات لنقل كل مستحلب متجانس إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة مليليترين مُصنف. قم بتقسيم المتبقي من المستحلب المتجانس إلى أنابيب إضافية مُصنفة سعة 1.5 مليليتر بطريقة مماثلة للتخزين عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. للمتابعة في عملية التجزئة، أضف 100 ميكروليتر من كلوريد الصوديوم بتركيز خمسة مولار و100 ميكروليتر من الساركوسيل بتركيز 10% إلى كل جزء مقسم بحجم 0.8 مليليتر.امزج جيداً عن طريق القلب. ثم قم بالتحضين على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد التحضين، استخدم جهاز سونيكيتر مزوداً بمسبار دقيق لتوجيه ثلاث نبضات مدة كل منها خمس ثوانٍ عند سعة 30%.بعد استخدام طريقة حمض البيكنسينونينيك لتحديد تركيزات البروتين في المتجانسات، أضف منظم سارك (Sark buffer) مبرداً بالثلج مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز إلى كل عينة حتى يصل التركيز النهائي إلى 10 mg/mL. ثم انقل 500 µL من كل عينة إلى أنابيب طرد مركزي فائق من البوليكربونات سعة 500 µL. ضع الأنابيب في دوار مبرد مسبقاً وقم بإجراء الطرد المركزي الفائق عند 180,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.بعد عملية الطرد المركزي، انقل السوائل الطافية S1 القابلة للذوبان في الساركوزيل إلى أنابيب سعة 1.5 مل وخزنها عند درجة حرارة -80 °C. أضف 200 µL من محلول السارك المنظم (sark buffer) إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق التي تحتوي على أجزاء P1 غير القابلة للذوبان في المنظفات، واستخدم طرف الماصة لفصل الرواسب عن قاع أنابيب الطرد المركزي الفائق. بعد ذلك، انقل رواسب P1 التي تمت إعادة تعليقها إلى أنابيب طرد مركزي فائق جديدة سعة 500 µL، مع موازنتها في أزواج، ثم قم بطردها مركزياً عند 180,000 ×g لمدة 30 دقيقة إضافية عند درجة حرارة 4 °C.تخلص من الطافي S2. ثم أضف من 50 إلى 75 µL من منظم urea مع مزيج مثبطات البروتياز والفوسفاتاز إلى الرواسب غير القابلة للذوبان في sarkosyl، واتركها للحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإذابة راسب P2. بعد الحضانة، انقل رواسب P2 المعاد تعليقها إلى أنابيب سعة 0.5 mL مُصنفة، وأذب الرواسب تماماً باستخدام الموجات فوق الصوتية عبر طرف دقيق (microtip) لمدة ثانية واحدة وبسعة 20%.قم بتحديد تركيزات البروتين في الأجزاء القابلة للذوبان في الساركوسيل (sarkosyl-soluble) وغير القابلة للذوبان في الساركوسيل (sarkosyl-insoluble) باستخدام طريقة مقايسة BCA. قم بتحضير عينات بتركيز 40 µg من المتجانس الكلي، والجزء S1 القابل للذوبان في الساركوسيل، والجزء P2 غير القابل للذوبان في الساركوسيل في محلول منظم لعينات Laemmli SDS-PAGE بتركيز 1x مع 5 mM من TCEP عند pH 7. قم بحضن العينات عند 95 °C لمدة خمس دقائق.قم بتحميل العينات على هلامات SDS-PAGE من نوع Bis-Tris مسبقة الصب بـ 10 آبار وبتركيز يتراوح من 4 إلى 12 بالمائة. قم بإجراء الرحلان الكهربائي بجهد 80 فولت للسنتيمتر الأول و120 فولت لمدة ساعة تقريبًا أو حتى يصل صبغ التتبع إلى أسفل الهلام. اغمر كاسيتات الهلام مسبقة الصب في ماء مقطر، ثم استخدم شفرة حلاقة جديدة وسكين هلام لفتحها.قم بقص الأمشاط والجزء السفلي تماماً من كل هلام بلطف باستخدام شفرة حلاقة جديدة. ثم انقل البروتينات إلى أغشية نيتروسليلوز بمسامية 0.2 micron باستخدام طريقة النقل الجاف على جهاز النقل الكهربائي (blotting machine). بعد النقل، قم بحجب الأغشية في محلول حجب (blocking buffer) خالٍ من Tween-20 لمدة 30 دقيقة، يليه محلول حجب يحتوي على 0.5 percent من Tween-20 لمدة 30 دقيقة.بعد عملية الحجب، اشطف الأغشية باستخدام TBS مع 0.1% من Tween-20 لمدة خمس دقائق لإزالة محلول الحجب الزائد. قم بتحضير تخفيفات بنسبة 1:1,000 من الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب مع 0.5% من Tween-20. تم استخدام Phospho-Tau pT231 و EEA1 في هذه التجربة.قم بتحضين الأغشية في محلول الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب الدائري. وفي اليوم التالي، اشطف الأغشية في محلول TBS الذي يحتوي على 0.1% من Tween-20 ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة. ثم يتم فحص الأغشية باستخدام تخفيف بنسبة 1:20,000 من الجسم المضاد الثانوي المسمى فلوريسنتياً بالأشعة تحت الحمراء القريبة ومحلول حجب يحتوي على 0.5% من Tween-20 لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام فوق جهاز هزاز.بعد انتهاء فترة التحضين، اشطف الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في محلول TBS مع 0.1% من Tween-20، ومرتين في محلول TBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بمسح الغشاء باستخدام نظام تصوير بالأشعة تحت الحمراء عند طول الموجة الإثاري المناسب للأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. يظهر هذا الهلام المصبوغ بصبغة Coomassie كمية 20 mcg من البروتين من أجزاء TH-S وS1 وS2 وP2.يُظهر تحليل Western blot بوضوح أنه في دماغ مرضى AD، تتجمع بروتينات Tau المفسفرة ذات الوزن الجزيئي العالي المرضية مع الساركوزيل غير القابل للذوبان، بينما تبقى كمية قليلة جداً من phospho-Tau في أجزاء الساركوزيل. استُخدم EEA1 كعلامة عامة لمعظم البروتينات الأصلية غير المرضية التي تكون بطبيعتها قابلة للذوبان في الساركوزيل وتتوزع في الجزء S1 في كل من دماغ المجموعة الضابطة ودماغ مرضى AD. ومن الملاحظ وجود إشارة أقل قليلاً لـ EEA1 في الجزء القابل للذوبان مقارنة بجزء TH-S، مما يشير إلى أن هناك تجمعاً صغيراً من EEA1 من المرجح أن يكون غير قابل للذوبان في الساركوزيل، ولكنه يظل دون حد الكشف بواسطة Western blot باستخدام هذا الجسم المضاد تحديداً.يوضح هذا الشكل التحليل البروتومي لبروتينات مرض الزهايمر (AD) المرضية باستخدام بروتوكول تجزئة أحادي الخطوة أو متعدد الخطوات. قد تكون تقنية التجزئة أحادية الخطوة مفيدة للبروتينات ذات الوفرة المنخفضة، حيث يتم تقليل الفقد الإجمالي في العينة بشكل كبير. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استئصال أكبر قدر ممكن من المادة البيضاء من أنسجة الدماغ.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل البروتوميات القائمة على مطيافية الكتلة من أجل تحديد وتوصيف المكونات البروتينية الأساسية للتجمعات المرضية في أمراضها التنكسية.

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

عدم تجانس الخلوي للأنسجة المخ يشكل قيدا هاما لدراسة علامات جينية في لونين لأن معظم فحوصات نقص واحد قرار الخلية. الخلايا العصبية عادة ما تختلط مع الخلايا الدبقية وغيرها من المنظمات غير العصبية. ونحن نقدم على بروتوكول لاستخراج وجمع النوى من الخلايا العصبية في الدماغ البشري.

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

وصفنا تقنية لإعداد الخليط أوضح القشرية الإنسان ، وفصل البروتين SDS - PAGE ، واسترجاع مستضد immunoblotting مع الضد إلى الببتيد Aβ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن باستمرار اكتشاف Aβ موحودي multimeric في الأنسجة والقشرية من البشر مع أمراض الزهايمر.

SDS-PAGE/Immunoblot الكشف عن Multimers Aβ في الأنسجة البشرية القشرية الخليط باستخدام مستضد استرجاع حاتمة

نوع جديد من بروتين بريون الخلوي (بي ار...

عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي

يوضح هذا الفيديو بروتوكول عزل ألياف الأميلويد من مستخلص أنسجة دماغ الفئران باستخدام الكثافة والتدرج المركزي وهضم البروتينات غير النشوانية.

عزل ألياف الأميلويد من مستخلص أنسجة المخ

يشرح هذا الفيديو عملية عزل وإثراء مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة المخ البشري المجمدة بعد الوفاة. يوضح الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك التجانس ، ومعالجة المنظفات ، والصوتنة ، والطرد المركزي الفائق لفصل وتنقية الركام غير القابل للذوبان. تتضمن الخطوة الأخيرة إذابة الركام في مخزن اليوريا لمزيد من التحليل.

عزل مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة

بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.

بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل ألفا سينوكلين (α-syn) غير القابل للذوبان / المجمعة بشكل متزايد من أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. من خلال استخدام المخازن المؤقتة ذات قوة المنظفات المتزايدة وتقنيات الطرد المركزي الفائق عالية السرعة ، يمكن فحص الخصائص المتغيرة لتجميع α-syn في الأنسجة المريضة وغير المريضة.

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.

مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية

تسهل طريقة التنقية البيوكيميائية هذه مع التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي التوصيف القوي لنوى ألياف الأميلويد ، مما قد يسرع من تحديد الأهداف للوقاية من مرض الزهايمر.

التنقية البيوكيميائية والتوصيف البروتيني للنوى الليفية الأميلويد من الدماغ

توضح هذه الدراسة طرقا تجريبية لتوصيف GFAP وطفراته المسببة للأمراض كيميائيا، مع التركيز على تجميع الخيوط، والتجميع، والتعديل بعد الترجمة. تم تحليل بروتينات GFAP عالية النقاء، مما كشف عن رؤى حول آليات مرض ألكسندر قد توفر إطارا لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة وفهم طفرات GFAP والاضطرابات المرتبطة بها.

الأساليب التجريبية للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي ومتغيرات المرض المرتبطة به

تعلم بروتوكول تجزئة لإثراء مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة التراكمات البروتينية المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية.

إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

استكشف المزيد من الفيديوهات