June 28th, 2017
يصف هذا البروتوكول تنفيذ غير المتماثلة الكشف عن الوقت المجهر نظام المجهر الضوئي لتصوير خلية واحدة في تدفق فائق السرعة ميكروفلويديك وتطبيقاتها في التصوير التدفق الخلوي.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو إعداد واستخدام نظام مجهر بصري ممتد للكشف غير المتماثل عن التصوير أحادي الخلية عالي التباين الخالي من الملصقات في تدفق الموائع الدقيقة فائق السرعة. الميزة الرئيسية ل ATOM هي أنه يسمح بالتقاط صور فائق السرعة مع معدلات مسح خطي تصل إلى عشرات الميجاهرتز مع تحسين تباين الصورة على الخلايا غير المصنفة. يتيح ATOM التحليل المورفولوجي المعقد للهياكل الخلوية وتحت الخلوية باستخدام فحوصات قائمة على الخلايا غير مدخلة تصل إلى 100،000 خلية في الثانية ، وهو أمر غير ممكن مع قياس التدفق الخلوي القياسي.
لبدء إعداد النظام ، استخدم موازة ألياف لإقران فيمتو عريض النطاق أو بيكو ثانية بالقرب من الليزر النبضي بالأشعة تحت الحمراء بألياف ضوئية مشتتة أحادية الوضع متصلة بمكبر صوت بصري. قم بإضاءة درجات حيود الإرسال باستخدام الليزر لإنتاج دش طيفي. قم بتوجيه التسوية بالقرب من تكوين littrow لزيادة كفاءة الانعراج.
قم بتكوين مجموعة عدسة مرحل تلسكوبية في نظام تصوير 4f لتوجيه الدش الطيفي إلى المستوى البؤري الخلفي لعدسة موضوعية أسفل منصة العينة. تأكد من أن الدش الطيفي يملأ الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية. ضع عدسة شيئية أخرى مع مرآة مستوية في فتحة العدسة الخلفية فوق منصة العينة.
اضبط العدسات الموضوعية حتى تتداخل مستوياتها البؤرية. تحقق من أن الدش الطيفي يمر مزدوجا بمستوى الصورة ويتبع نفس المسار مرة أخرى إلى التقدير. ضع شريحة موائع دقيقة على منصة العينة وتأكد من سقوط الدش الطيفي عبر قناة الموائع الدقيقة.
أعد توجيه الضوء المرتجع باستخدام مقسم الشعاع بعد مروره عبر التقدير. افصل الضوء المرتجع إلى شعاعين باستخدام مقسم شعاع آخر. استخدم موازاءات الألياف لربط الحزم بألياف أحادية الوضع بأطوال مختلفة لإدخال تأخير زمني بين الحزم.
قم بتوصيل الألياف براسم الذبذبات في الوقت الفعلي من خلال مقرنة ألياف وكاشف ضوئي. اضبط كسب مكبر الصوت البصري حتى تصبح نسبة الإشارة إلى الضوضاء للإشارة الضوئية أكبر من 10 ديسيبل. ثم قم بحظر ما يقرب من نصف كل شعاع تم إرجاعه باستخدام كتل شعاع حافة السكين.
اضبط كتل الحزمة حتى تصل الطاقة الضوئية المقاسة في كل ألياف إلى حوالي نصف الطاقة قبل الكتلة. تحقق من أن عرض النطاق الترددي للذبذبات ومعدل أخذ العينات مرتفعان بما يكفي لعدم التأثير على دقة الصورة. لبدء التجربة ، قم بتخفيف عينات الخلايا إلى ما بين 10 إلى 5 و 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو مياه الينابيع.
ثم قم بتحميل محلول الخلية في حقنة سعة 10 ملليلتر. قم بتوصيل المحقنة بمدخل قناة الموائع الدقيقة. قم بتوجيه مخرج قناة الموائع الدقيقة إلى أنبوب الطرد المركزي.
قم بتأمين المحقنة في مضخة حقنة واضبط معدل التدفق بشكل مناسب لعرض القناة. اختر عدد نقاط البيانات التي سيتم حفظها للتجربة. ثم احصل على بيانات الإشارة الضوئية واحفظها.
رقمنة البيانات وتصديرها من راسم الذبذبات إلى جهاز كمبيوتر. قم بمعالجة البيانات إلى صور ثنائية الأبعاد واستخرج مكتبة من المعلمات من الصور. قم باستيراد الصور الموجودة في مكتبة المعلمات إلى برنامج تصور.
قم بتعيين معلمة ذات أهمية لكل محور وحدد مجموعة البيانات المراد عرضها كمخطط مبعثر. تحقق من صور الخلايا المقترنة بكل مجموعة في المؤامرة لتحديد الاتجاهات. استخدم البوابات اليدوية أو اعرض مجموعات بيانات إضافية لمزيد من التحليل حسب الحاجة.
تم استخدام ATOM للحصول على صور خلية واحدة عالية التباين للخلايا البشرية والعوالق النباتية. تظهر هياكل الخلايا المميزة مثل الفجوات والبيرينويدات والسوط في صور العوالق النباتية. تم تحديد معلمات مثل حجم الخلية والدائرية من صور ATOM لتصنيف الخلايا لتحليل القياس الخلوي.
يمكن عرض نتائج التصنيف كمخططات مبعثرة ثنائية الأبعاد. هنا تم رسم الحجم مقابل الدائرية ل MCF7 الموضح باللون الأصفر و PBMC الموضح باللون الأحمر. لوحظت مجموعتان ل MCF7.
من خلال تحديد الصور عالية التباين المقابلة لنقاط البيانات الفردية ، وجد أن المجموعة السفلية تتوافق مع شظايا الخلايا والحطام. بمجرد إتقان نظام التصوير ، يمكن إعداده في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. يمكن إجراء إجراءات التصوير في غضون ساعة.
لا تنس إيلاء اهتمام خاص لسلامة العين أثناء العمل مع مصدر الليزر ومحاذاة شعاع الليزر. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء نظارات السلامة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر مراقبة محاذاة الحزمة الضوئية طوال عملية إعداد نظام التصوير بأكملها لضمان جودة التصوير المثلى.
في حين أن هذه التقنية يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة للكشف عن الخلايا النادرة أو الظاهرة وقياسها أثناء عملية المرض ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تصنيف نوع الخلايا ، داخل مجموعات الخلايا الكبيرة وغير المتجانسة. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند البحث عن التغلب على قيود الإنتاجية لقياس الخلايا التصويري ، مع الحفاظ على جودة الصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ ATOM من إعداد النظام إلى إجراءات التصوير.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
يصف هذا البروتوكول تنفيذ نظام مجهر بصري ضوئي متباين غير متماثل لتصوير الخلايا المفردة عالية التباين بدون علامات في تدفق مائعي دقيق فائق السرعة. يسمح نظام ATOM بالتقاط الصور بسرعة فائقة وتحسين تباين الصورة على الخلايا غير الموسومة، مما يسهل التحليل المورفولوجي المعقد.
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.